Automatisering av bearbetning av citrusknoppved för nedströms patogendetektering genom instrumentteknik

Summary

Vi konstruerade, tillverkade och validerade ett instrument som snabbt bearbetar floemrika barkvävnader från citrusknoppar. Jämfört med nuvarande metoder har budwood tissue extractor (BTE) ökat provgenomströmningen och minskat de nödvändiga arbets- och utrustningskostnaderna.

Abstract

Transplantatöverförbara, floembegränsade patogener av citrusfrukter som virus, viroider och bakterier är ansvariga för förödande epidemier och allvarliga ekonomiska förluster över hela världen. Till exempel dödade citrus tristeza-viruset över 100 miljoner citrusträd globalt, medan “Candidatus Liberibacter asiaticus” har kostat Florida 9 miljarder dollar. Användningen av patogentestad citrusknoppved för trädförökning är avgörande för hanteringen av sådana patogener. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) vid University of California, Riverside, använder PCR-analyser (polymeraskedjereaktion) för att testa tusentals prover från citrusknoppar varje år för att skydda Kaliforniens citrusfrukter och för att tillhandahålla rena förökningsenheter till National Clean Plant Network. En allvarlig flaskhals i den storskaliga molekylära detektionen av citrusvirus och viroider är bearbetningssteget för växtvävnad.

Korrekt vävnadsberedning är avgörande för extraktion av nukleinsyror av hög kvalitet och nedströms användning i PCR-analyser. Att hacka, väga, frystorka, mala och centrifugera växtvävnad vid låga temperaturer för att undvika nukleinsyranedbrytning är tids- och arbetskrävande och kräver dyr och specialiserad laboratorieutrustning. Denna artikel presenterar valideringen av ett specialiserat instrument konstruerat för att snabbt bearbeta floemrika barkvävnader från citrusknoppved, kallat budwood tissue extractor (BTE). BTE ökar provgenomströmningen med 100 % jämfört med nuvarande metoder. Dessutom minskar det arbetskraften och kostnaden för utrustning. I detta arbete hade BTE-proverna ett DNA-utbyte (80,25 ng/μL) som var jämförbart med CCPP:s handhackningsprotokoll (77,84 ng/μL). Detta instrument och det snabba bearbetningsprotokollet för växtvävnad kan gynna flera citrusdiagnostiska laboratorier och program i Kalifornien och bli ett modellsystem för vävnadsbearbetning för andra vedartade perenna grödor över hela världen.

Introduction

Transplantatöverförbara floembegränsade patogener av citrusfrukter, såsom viroider, virus och bakterier, har orsakat förödande epidemier och allvarliga ekonomiska förluster i alla citrusproducerande områden i världen. Citrusviroider begränsar produktionsfaktorer på grund av de exokortis- och kakexisjukdomar som de orsakar i ekonomiskt viktiga citrustyper, såsom trifoliat, trifoliathybrider, mandariner, klementiner och mandariner ^1,2,3. I Kalifornien är dessa viroidkänsliga citrustyper grunden för den växande och lönsamma marknaden för “lättskalade”, vilket följer den skiftande trenden i konsumenternas preferens för frukter som är lätta att skala, segmenterade och kärnfria ^4,5,6. Således regleras citrusviroider enligt California Department of Food and Agriculture (CDFA) “Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140”, och laboratorierna i CDFA:s Plant Pest Diagnostics Branch utför tusentals citrusviroidtester årligen 7,8,9,10 . Citrus tristeza-virus (CTV) har orsakat döden av över 100 miljoner citrusträd sedan början av den globala epidemin på 1930-talet 3,9,10,11. I Kalifornien utgör stamgropar och trifoliatbrytande resistensisolat av viruset ett allvarligt hot mot Kaliforniens citrusindustri som omsätter 3,6 miljarder dollar^12,13,14. Följaktligen klassificerar CDFA CTV som en reglerad klass A-växtskadegörare, och laboratoriet vid Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) utför omfattande fältundersökningar och tusentals virustester varje år^15,16. Bakterien “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) och huanglongbing-sjukdomen (HLB) beräknas ha orsakat nära 9 miljarder dollar i ekonomisk skada för Florida som ett resultat av en 40-procentig minskning av citrusarealen, en 57-procentig minskning av citrusodlingen och en förlust av nästan 8 000 arbetstillfällen^17,18. I Kalifornien förutspåddes en hypotetisk 20-procentig minskning av citrusarealen på grund av HLB leda till mer än 8 200 förlorade arbetstillfällen och en minskning av delstatens bruttonationalprodukt med över en halv miljard dollar. Därför spenderar Citrus Pest and Disease Prevention Program över 40 miljoner dollar årligen på undersökningar för att testa, upptäcka och utrota CLas från Kalifornien^14,17,19,20.

En viktig del av hanteringen av citrusviroider, virus och bakterier är användningen av patogentestade förökningsmaterial (t.ex. knoppved) för trädproduktion. Patogentestad citrusknoppved produceras och underhålls inom omfattande karantänprogram som använder avancerade tekniker för eliminering och detektion av patogener^10,21. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) vid University of California, Riverside, testar tusentals knoppträprover varje år från citrussorter som nyligen importerats till delstaten och USA, samt träd från citrusknoppar, för att skydda Kaliforniens citrus och stödja funktionerna hos National Clean Plant Network for Citrus^10,17,22. För att hantera den stora volymen citrustester är tillförlitliga och kostnadseffektiva patogendetektionsanalyser med hög genomströmning en grundläggande komponent för framgång för program som CCPP ^7,10,22.

Även om molekylbaserade patogendetektionsanalyser som polymeraskedjereaktion (PCR) har möjliggjort betydande ökningar av genomströmningen i växtdiagnostiska laboratorier, är enligt vår erfarenhet en av de mest kritiska flaskhalsarna i implementeringen av protokoll med hög genomströmning bearbetningssteget för växtvävnadsprover. Detta gäller särskilt för citrusfrukter eftersom de för närvarande tillgängliga protokollen för bearbetning av floemrika vävnader som bladskaft och knoppvedsbark är arbetskrävande, tidskrävande och kräver dyr och specialiserad laboratorieutrustning. Dessa protokoll kräver handhackning, vägning, frystorkning, malning och centrifugering vid låga temperaturer för att undvika nukleinsyranedbrytning 8,23,24. Vid diagnoslaboratoriet CCPP omfattar provbearbetningen till exempel i) handhackning (6–9 prover/h/operatör), ii) frystorkning (16–24 timmar), iii) pulverisering (30–60 s) och iv) centrifugering (1–2 timmar). Processen kräver också specialutrustning (t.ex. kraftiga safe-lock-rör, slipkulor i rostfritt stål, adaptrar, blad, handskar) och flera delar av dyr laboratorieutrustning (t.ex. ultralåg frys, frystork, vävnadspulveriserare, kryostation med flytande kväve, kylcentrifug).

Som i alla branscher är utrustningsteknik och automatisering av processer nyckeln till att sänka kostnaderna, öka genomströmningen och tillhandahålla högkvalitativa, enhetliga produkter och tjänster. Citrusindustrin behöver billiga instrument för bearbetning av vävnader som kräver minimal skicklighet för att fungera och som därför är lätta att överföra till diagnostiska laboratorier och fältverksamhet för att möjliggöra hög provbearbetningskapacitet för snabb upptäckt av patogener nedströms. Technology Evolving Solutions (TES) och CCPP utvecklade (dvs. designar och tillverkar) och validerade (dvs. testade med citrusprover och jämförde med standardlaboratorieprocedurer) ett billigt (dvs. eliminerade behovet av specialiserad laboratorieutrustning) instrument för snabb bearbetning av floemrika citrusvävnader (dvs. knoppved), kallat budwood tissue extractor (BTE). Som framgår av figur 1 innehåller BTE en baskomponent för ström och kontroller, plus en avtagbar kammare för bearbetning av citrusknoppved. BTE-kammaren består av en slipskiva som är speciellt utformad för att ta bort de floemrika barkvävnaderna från citrusknoppen. Den strimlade barkvävnaden matas snabbt ut genom en glidport till en spruta som innehåller extraktionsbuffert, filtreras och görs redo för nukleinsyraextraktion och rening utan ytterligare hantering eller beredning (figur 1). BTE-systemet innehåller också en papperslös provspårningsapplikation och en integrerad vägningsapplikation, som registrerar provbehandlingsinformationen i en onlinedatabas i realtid.

BTE-systemet har ökat CCPP:s laboratoriediagnostiska kapacitet med över 100 % och har konsekvent producerat extrakt av citrusvävnad som är lämpliga för rening av nukleinsyror av hög kvalitet och nedströms detektion av transplantatöverförbara patogener av citrusfrukter med hjälp av PCR-analyser. Mer specifikt har BTE minskat tiden för vävnadsbearbetning från över 24 timmar till ~3 minuter per prov, ersatt laboratorieinstrument som kostar över 60 000 USD (figur 2, steg 2-4) och möjliggjort bearbetning av större provstorlekar.

Detta dokument presenterar BTE-högkapacitetsbearbetning av citrusbarkvävnadsbearbetning, nukleinsyraextraktion och valideringsdata för patogendetektion med citrusknoppsprover från källträd, inklusive alla lämpliga positiva och negativa kontroller från CCPP Rubidoux Quarantine Facility respektive Lindcove Foundation Facility. Vi presenterar också genomströmnings- och bearbetningstidsförändringarna jämfört med den nuvarande laboratorieproceduren (Figur 2). Dessutom ger detta arbete ett detaljerat, steg-för-steg-protokoll för testlaboratorier för citruspatogener och visar hur BTE kan stödja funktionerna hos patogenrena plantskole-, undersöknings- och utrotningsprogram.

Figur 1: Vävnadsextraktor av knoppträ. BTE innehåller en baskomponent för kraft och kontroller, plus en avtagbar kammare för bearbetning av citrusknoppved. BTE-kammaren består av en slipskiva som är speciellt utformad för att ta bort de floemrika barkvävnaderna från citrusknoppved. Den strimlade barkvävnaden matas snabbt ut genom en glidport i en spruta, filtreras och görs redo för nukleinsyraextraktion och rening utan ytterligare hantering eller förberedelse. Förkortning: BTE = budwood tissue extractor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Steg-för-steg-jämförelse mellan den konventionella handhackningsproceduren i labbet och BTE-bearbetning. BTE-bearbetning involverar bearbetning av citrusbarkvävnad med hög kapacitet, nukleinsyraextraktion och patogendetektering. Tiden för varje steg anges inom parentes. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

1. Samla in proverna av citrusknoppträ som ska skickas Skicka Technology Evolving Solutions ett kalkylblad med trädinformation som de kan läsa in på sin webbserver (så småningom kommer användaren att skapa nya träd). Använd telefonappen TES-spåraren för att välja ett träd och håll en NFC-halsbandstagg mot telefonen för att läsa in trädinformationen till taggen. Sätt in tre till fyra citrusknoppsprover i den BTE-kompatibla plastpåshållaren…

Representative Results

RNA-extraktion, rening och kvalitet med hjälp av BTE-bearbetad citrusvävnad från knoppved och bedömning av tid för vävnadsbearbetningVi använde knoppvedsprover från 255 representativa citrusträd för detta test för att jämföra RNA-kvaliteten från BTE jämfört med standardproceduren. Proverna bearbetades med budwood tissue extractor (BTE) (protokollsteg 4.1-4.6 och figur 2, höger sida, steg 1, steg 5 och steg 6) eller framställdes enligt den regulatoriskt …

Discussion

I och med tillkomsten av HLB-citrussjukdomen har citrusindustrin, tillsynsmyndigheter och diagnostiska laboratorier uppmanats att förlita sig på nukleinsyraextraktionsmetoder med hög genomströmning i kombination med manuell provbearbetning med låg genomströmning och patogendetektionsanalyser som qPCR³⁴ för testning av enskilda träd, i kombination med metoder för sjukdomshantering³⁵. Kaliforniens HLB-positivitetsgrad har gått från 0,01 % 2012 till 1,2 % 2020. Äve…

Materials

0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4×12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line