Den nuværende protokol opdaterer tidligere protokoller og inkorporerer relativt enkle tilgange til dyrkning af cochlea-eksplantater af høj kvalitet. Dette giver pålidelig dataindsamling og billeddannelse i høj opløsning i levende og faste celler. Denne protokol understøtter den igangværende tendens til at studere indre øreceller.
Ubehandlet høretab medfører betydelige omkostninger for det globale sundhedssystem og forringer den enkeltes livskvalitet. Sensorineuralt høretab er kendetegnet ved det kumulative og irreversible tab af sensoriske hårceller og auditive nerver i cochlea. Hele og vitale cochlear eksplantater er et af de grundlæggende værktøjer i høreforskning til at opdage hårtab og til at karakterisere de molekylære mekanismer i de indre øreceller. For mange år siden blev der udviklet en protokol for neonatal cochlear isolation, og selvom den er blevet ændret over tid, har den stadig potentiale for forbedring.
Dette papir præsenterer en optimeret protokol til isolering og dyrkning af hele neonatale cochlear eksplanter i multi-well kulturkamre, der muliggør undersøgelse af hårceller og spiralganglion neuron celler langs hele længden af cochlea. Protokollen blev testet ved hjælp af cochlear explants fra mus og rotter. Sunde cochlear explants blev opnået for at studere interaktionen mellem hårceller, spiralganglion neuron celler og de omgivende støtteceller.
En af de største fordele ved denne metode er, at den forenkler orgelkulturtrinnene uden at gå på kompromis med kvaliteten af eksplanterne. Alle tre drejninger af Corti-organet er fastgjort til bunden af kammeret, hvilket letter in vitro-eksperimenter og den omfattende analyse af eksplanterne. Vi giver nogle eksempler på cochlear billeder fra forskellige eksperimenter med levende og faste eksplanter, der viser, at eksplanterne bevarer deres struktur på trods af eksponering for ototoksiske lægemidler. Denne optimerede protokol kan i vid udstrækning anvendes til integrativ analyse af pattedyrs cochlea.
De fleste tilfælde af sensorineuralt høretab skyldes degeneration af sensoriske hårceller, auditive nerveceller og/eller auditive synapser1. Denne degenerative proces i sensoriske celler er progressiv og normalt irreversibel, hvilket resulterer i høretab2. Derfor er information om sensoriske cellers levedygtighed og ændringer i signalveje under stressforhold afgørende for at beskytte cellerne mod skader og dermed tab. Undersøgelsen af cochlear explants i kultur muliggør rekapitulation af vævskomplekset og vedligeholdelse af et normalt celle-cellenetværk, hvilket muliggør en bedre beskrivelse af signalprocesserne. For at etablere eksperimentelle modeller for ototoksicitet er antibiotika gentamicin og det kemoterapeutiske middel cisplatin ofte blevet brugt, fordi de vides at have ototoksiske bivirkninger3.
In vitro kultursystemer af cochlear explants er blevet udviklet og modificeret over tid; Imidlertid mangler en beskrivelse af den trinvise protokol for kulturen af hele cochlear explants ofte i flere publikationer. En af de første videoprotokoller for den primære kultur af Cortis murinorgan blev offentliggjort af Parker et al., Hvor forfatterne beskrev trinene til isolering af det sensoriske epitel, dyrkning på glasdæksler og elektroporation af eksplanter til transfektionseksperimenter4. En anden protokol, der bruger glasdæksedler, blev også tidligere offentliggjort, hvor organiseringen af cellulær struktur i det indre øre blev betragtetsom 5. En alternativ protokol med anvendelse af millicellemembran til dyrkning af museeksplanter af Corti-organet og det vestibulære organ er blevet rapporteret6. Disse videorapporter har bidraget til forbedringen af metoden, men der er stadig udfordringer, der skal løses. For at løse en række problemer, der opstår som følge af brugen af glasdæksler og -indsatser, sigter denne protokol mod at strømline trinnene i organkultur og dyrke organer af høj kvalitet for at opnå pålidelige data. Dette opnås ved at minimere den direkte håndtering af organet under de eksperimentelle procedurer og undgå organoverførsel, før der opnås billeder i høj opløsning af de levende og faste celler.
Denne protokol opdaterer tidligere offentliggjorte in vitro-kultursystemer og introducerer flere optimeringer i isoleringen af Corti-organet og overførsel til kulturkamrene samt integrationen af et nyt diaskammer for at forbedre dyrkningsforholdene og yderligere analyse. Denne optimerede protokol reducerer risikoen for beskadigelse af orglet, hvilket kan opstå ved brug af glasdæksler under medieskift eller under overførsel af organet fra dæksler eller membraner til yderligere analyse 4,5,6. Glasdækslerne har et bedre reflekterende indeks end plastik; De er dog skrøbelige og kan lettere gå i stykker. De multibrøndskamre, der anvendes her, er fastgjort til et mikroskopglas, som er velegnet til orgelkultur og til billeddannelse i høj opløsning. Overførslen af de isolerede organer udføres med en spatel, som gør det muligt at bringe organet i den rigtige retning og glide ind i kammeret i stedet for at anvende kraft med en pipette som tidligere anbefalet 4,5,6.
De poly-D-lysinbelagte multibrøndskamre, som skal indeholde tilstrækkeligt medium, letter organoverførslen og den korrekte placering af eksplanterne uden at anvende klæbetryk og samtidig undgå organoverlapning, som tidligere nævnt6. Derudover løses utilsigtede organoverlappende og ujævne strukturer ved hjælp af en konfokal Z-stak. Denne protokol er optimeret til forskellige applikationer, såsom muse- og rotteeksplanter, eksplanter af Corti- og cochlea-organet, kultur i serumholdigt og serumfrit medium, ototoksiske vurderinger og generelle lægemiddelresponseksperimenter. Cochlear explants monteres og inkuberes i kamre med en dækslipbund, hvilket letter vedhæftningen af cochlear explants til kamrene for optimal håndtering under in vitro-forsøgene , efterbehandling af eksplanterne og billeddannelse af levende og faste cochlear explants. Visualiseringen af hele længden af Corti-organet og kvantificeringen af hårceller strømlines. Derudover er vurderingerne af støttecellerne, spiralganglionneuronceller og neuritter nøjagtige. Derfor kan denne protokol anvendes til en omfattende analyse af pattedyrs cochleære celler.
Formålet med at opdatere denne protokol var at strømline trinnene fra isolering af eksplantaterne til billeddannelse af de levende og faste cochlear celler. Vi forbedrede nogle trin under isoleringen og introducerede nogle innovative værktøjer med det formål at etablere en effektiv og velfungerende protokol for at opnå explants af høj kvalitet. Den beskrevne metode er en optimeret protokol fra tidligere rapporter 4,5. Derudover mangler nogle aktuelle undersøgelser en trinvis opdateret protokol. Med forenklede trin i eksplantatkulturen giver denne protokol nem håndtering af velbevarede eksplantater, hvilket er afgørende for reproducerbare data. Indførelsen af multibrøndskamre med et polymerdæksel til ydre øreeksplanter forbedrer organfastgørelsen og bevarelsen af intakte eksplanter. Her præsenterer vi flere eksempler på eksperimenter under stressforhold for at demonstrere, at organerne i kultur opretholder deres cellulære organisation på trods af tab af hårceller og skader på neuritterne.
En af udfordringerne ved at dyrke organer i det indre øre er at undgå organernes løsrivelse og svæven, da dette påvirker eksplanternes integritet, responsen på behandlingen og de efterfølgende undersøgelser. Tidligere blev explants dyrket på glasdæksler 4,5. Selvom kultur på glasoverflader synes at være et godt alternativ, er belægning af glasset tidskrævende, og selve dæksedlerne er skrøbelige og sarte. En alternativ protokol, der bruger Millicell-cellekulturindsatser, forsøger at løse dette problem6. Imidlertid synes skæring og overførsel af membranen med eksplanterne at være et delikat trin i denne protokol. Derudover kan eksplanterne blive beskadiget under montering og forsegling af dæksedlen. I vores foreslåede tilgang, når eksplanterne er overført til poly-D-lysinbelagte kamre og placeret i den korrekte position, er der ikke behov for yderligere overførsel eller dækning med dæksedler. En yderligere fordel ved denne protokol er brugen af kamre med et tyndt gasgennemtrængeligt polymerdæksel, der giver optimale dyrkningsbetingelser for organeksplanterne. Denne polymer har en optisk kvalitet svarende til glas, hvilket gør den velegnet til cellebilleddannelse i mikroskopi med høj opløsning.
Tilsætningen af serum til mediet anvendes i de fleste protokoller til celle- og vævskultur, herunder dyrkning af eksplantater i det indre øre med 1% -10% FBS 4,5,6,16. Tilstedeværelsen af serum påvirker eksperimenternes dyrkningsbetingelser; I visse situationer foretrækkes således kultur uden serum. Fraværet af serum i kulturen af cochlear explants blev erstattet enten ved tilsætning af N2 til DMEM eller ved tilsætning af N2 til Neurobasal-A medium 5,6. I den forbindelse testede vi dyrkningsforholdene for eksplanterne med og uden serum. Under begge betingelser var cellerne i det indre øre vitale og reagerede på ototoksiske tilstande. Vi testede disse betingelser i 72 timer, men eksplanterne kan opretholdes i kultur i endnu længere tid, især når de inkuberes med serumfrit medium sammen med N2, B27 og vækstfaktorer, som foreslået i andre undersøgelser 5,16.
Ud over de generelle kritiske trin i isoleringen af det indre øre, såsom varigheden af organisoleringen og det anvendte antibiotikum, er der også nogle kritiske trin i denne protokol, som dog er håndterbare. Et af de kritiske trin i denne metode er relateret til mængden af medium, der forbliver i kammeret, efter at organet er indsat. Dette er optimeret til at holde explants i live og fastgjort til bundoverfladen. Et andet kritisk trin er relateret til den inkubationstid, der kræves for at tillade eksplanterne at fastgøre til bunden af kammeret. Inkubationstider længere end 2 timer med et par mikroliter medium kan påvirke eksplanternes sundhed. Kortere inkubationstider, såsom 1 time, kan også bruges, så længe man passer på ikke at løsne eksplanterne. Et andet vigtigt aspekt er resterne af poly-D-lysin. Vasketrinnene af poly-D-lysin bør følges nøje, fordi rester af bromidsaltet af poly-D-lysin kan være giftige for cellerne. Efter at vasketrinnene er fulgt nøjagtigt, letter belægningen med poly-D-lysin den glatte vedhæftning af eksplanterne til kamrene, så positionen kan korrigeres, før de bliver fast fastgjort til bunden af kammeret.
En af begrænsningerne ved denne metode er billeddannelse af celler ved hjælp af opretstående mikroskopi. Dette kan være et vigtigt spørgsmål for laboratorier med inverterede mikroskoper. Glasskinner med aftagelige silikonekamre kan bruges til opretstående og omvendt mikroskopi; Vores overfladebehandlingsforhold med poly-D-lysin skal dog testes først. En yderligere begrænsning er opbevaringen af kamrene, fordi indsatserne ikke kan fjernes, og den samlede højde af et kammer med låget er næsten 11 mm sammenlignet med 1 mm højden på et standard mikroskopglas. Imidlertid bruger 8-brøndskammeret mindre plads end de 4-brøndplader, der blev foreslået før16.
Vi præsenterer her billeder erhvervet med to mikroskoper. Mens punktscanningskonfokalmikroskopet giver billeder i høj opløsning af væv på grund af dets tynde optiske sektion, giver det roterende skivekonfokale mikroskop en hurtigere billeddannelsestid med god opløsning. Stereocilierne i de indre hårceller (IHC’er) og de ydre hårceller (OHC’er) visualiseres ved hjælp af konfokal mikroskopi. Da stereocilia af IHC’er er større end OHC’ernes, blev de gentagne gange og godt visualiseret i dette arbejde. For OHC-stereocilia kan andre alternative mikroskoper forbedre visualiseringen, såsom superopløsningsmikroskopi (SRM). De eksplanterede billeder, der er erhvervet med spindeskivemikroskopet, er tilstrækkelige til nem integration af automatiseret hårcelletælling ved hjælp af en dyb læringsmetode12. Desuden er den korte anskaffelsestid vigtig for eksperimenter med levende celler og væv. Derudover er denne protokol ikke begrænset til neonatal cochlear explants. Med nogle optimeringer kan andre eksplanter såsom vestibulære organer eller embryonale væv også dyrkes.
Kvantificeringen af cochlearceller, såsom hårceller og neuroner, in vitro er vigtig for at vurdere cellernes levedygtighed og dermed procentdelen af beskadigede eller tabte celler. Undersøgelser af signalveje og cellefunktioner hjælper med at afsløre mekanismerne for død og overlevelse. Undersøgelser af embryonale og neonatale cochlear væv er nyttige til undersøgelse af udviklingsstadierne af cochlea. Derfor vil denne protokol bidrage til at optimere in vitro-undersøgelser af eksplanter i det indre øre, for eksempel for at etablere ototoksiske modeller, undersøge udviklingsstadier, evaluere signalveje og udføre lægemiddelscreeningsundersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende dyrefaciliteten ved Institut for Biomedicin ved universitetet i Basel for deres støtte inden for dyrepleje, mikroskopikernefaciliteterne samt informationsteknologitjenesten ved Institut for Biomedicin for deres tekniske bistand og Swiss National Science Foundation (SNSF) for økonomisk støtte (MD-ph.d.-stipendium til M.C., bevillingsnummer 323530_191222).
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
microscope | LEICA | M80 | |
microscope | LEICA | MS5 | |
MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |