Ce protocole décrit une méthodologie pour isoler et identifier les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSM) de rats Sprague Dawley.
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Article de méthode
Isolement et identification de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de rats Sprague Dawley
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules mésenchymateuses adultes ont révolutionné la biologie moléculaire et cellulaire au cours des dernières décennies. Ils peuvent se différencier en différents types de cellules spécialisées, en plus de leur grande capacité d’auto-renouvellement, de migration et de prolifération. Le tissu adipeux est l’une des sources les moins invasives et les plus accessibles de cellules mésenchymateuses. Il a également été rapporté pour avoir des rendements plus élevés par rapport à d’autres sources, ainsi que des propriétés immunomodulatrices supérieures. Récemment, différentes procédures pour obtenir des cellules mésenchymateuses adultes à partir de différentes sources de tissus et d’espèces animales ont été publiées. Après avoir évalué les critères de certains auteurs, nous avons normalisé une méthodologie applicable à différents usages et facilement reproductible. Un pool de fraction vasculaire stromale (SVF) provenant de tissus adipeux périrénaux et épididymaires nous a permis de développer des cultures primaires avec une morphologie et une fonctionnalité optimales. Les cellules ont été observées collées à la surface plastique pendant 24 h et présentaient une morphologie semblable à celle d’un fibroblaste, avec des prolongements et une tendance à former des colonies. Des techniques de cytométrie en flux (FC) et d’immunofluorescence (IF) ont été utilisées pour évaluer l’expression des marqueurs membranaires CD105, CD9, CD63, CD31 et CD34. La capacité des cellules souches dérivées du tissu adipeux (CSA) à se différencier dans la lignée adipogène a également été évaluée à l’aide d’un cocktail de facteurs (4 μM d’insuline, 0,5 mM de 3-méthyl-iso-butyl-xanthine et 1 μM de dexaméthasone). Après 48 h, une perte progressive de la morphologie fibroblastoïde a été observée, et à 12 jours, la présence de gouttelettes lipidiques positives à la coloration rouge d’huile a été confirmée. En résumé, une procédure est proposée pour obtenir des cultures d’ASC optimales et fonctionnelles pour une application en médecine régénérative.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont fortement impacté la médecine régénérative en raison de leur grande capacité d’auto-renouvellement, de prolifération, de migration et de différenciation en différentes lignées cellulaires 1,2. Actuellement, de nombreuses recherches se concentrent sur leur potentiel pour le traitement et le diagnostic de diverses maladies.
Il existe différentes sources de cellules mésenchymateuses: moelle osseuse, muscle squelettique, liquide amniotique, follicules pileux, placenta et tissu adipeux, entre autres. Ils sont obtenus à partir de différentes....
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Protocole
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux lignes directrices mexicaines sur les soins aux animaux, basées sur les recommandations de l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexique). Le protocole a été examiné, approuvé et enregistré par le Comité d’éthique pour la recherche en santé de l’Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Ablation du tissu adipeux de rats par résection chirurgicale
- Préparer deux tubes coniques avec 20 mL de solution antimycotique saline-antibiotique tampon....
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Résultats
Le tissu adipeux a été obtenu à partir de rats Sprague Dawley adultes âgés de 3 à 4 mois et pesant 401 ± 41 g (moyenne géométrique ± écart-type). Une valeur moyenne de 3,8 g de tissu adipeux pérididymaire et périrénal correspondait à l’analyse de 15 extractions expérimentales. Après 24 h de culture, les populations cellulaires sont restées collées à la surface plastique et présentaient une morphologie hétérogène. Le premier passage a été réalisé à 8 ± 2 jours, avec un rendement de 1,4 ± 0,6 x 106 cellules dans.......
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Discussion
Au cours des quatre dernières décennies, depuis la découverte des CSM, plusieurs groupes de chercheurs ont décrit des procédures pour obtenir des CSM à partir de différents tissus et espèces. L’un des avantages de l’utilisation de rats comme modèle animal est leur facilité d’entretien et leur développement rapide, ainsi que la facilité d’obtenir des CSM à partir de tissu adipeux. Différentes sources tissulaires ont été décrites pour obtenir des ASC, telles que la graisse viscérale, périrénale, épididymaire et sous-cutané.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs remercient l’Institut mexicain de sécurité sociale (IMSS) et l’Hôpital pour enfants du Mexique, Federico Gomez (HIMFG) et le personnel Bioterio de la coordination de recherche de l’IMSS, pour le soutien apporté à la réalisation de ce projet. Nous remercions le Conseil national de la science et de la technologie pour la bourse AOC (815290) et Antonio Duarte Reyes pour le soutien technique dans le matériel audiovisuel.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Amphotéricine B | HyClone | SV30078.01 | |
| Balance analytique | Sartorius | AX224 | |
| Anticorps anti-CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Anticorps anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Anticorps anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Anticorps anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Anticorps anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Anticorps de chèvre anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Anticorps Âne anti-chèvre IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Anticorps anti-souris IgG FITC chèvre conjuguée F (ab´ ;) | Systèmes RD. | N° F103B | |
| Filtre supérieur pour bouteille stérile | CORNING | 10718003 | |
| Fioles de culture cellulaire et tissulaire | BIOFIL | 170718-312B | |
| Compteur de cellules Bright-Line Hémacytomètre avec lames de chambre de comptage cellulaire | SIGMA Aldrich Z359629 | ||
| Puits de cellules : 6 puits avec couvercle | CORNING | 25810 | |
| Centrifugeuse Tubes | coniquesHeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifugeuse eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Tubes de culture | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Version | |
| Cytomètre CytoFlex LX | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 | Colorant Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Éosine jaunâtre | Hycel | 300 | |
| Éthanol 96 % | Baker | 64-17-5 | |
| Tubes Falcon 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Tubes Falcon 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Sérum fœtal bovin | CORNING | 35-010-CV | |
| Gélatine | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicine | GIBCO | 15750045 | |
| Glycérine-Haute Pureté | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hématoxyline | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubateur | Thermo Sc. | ||
| Ketamin Pet (Kétamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Microscope épifluorescent | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Microscope inversé | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Acides aminés non essentiels 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Microtubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Microtubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 &mu ; L | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 &mu ; L | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 &mu ; L | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 &mu ; L | Finnpipette | FJ39895 | |
| Réservoir d’azote liquide | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldéhyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Pénicilline / Streptomycine | GIBCO/ Thermo Sc. | ||
| Boîte de Pétri Culture cellulaire | CORNING Inc | 480167 | |
| Pointes de pipette | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodique) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Chlorure de potassium | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Phosphate de potassium dibasique | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Pipette sérologique 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Pipette sérologique 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Bicarbonate de sodium | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Chlorure de sodium | J.T.Baker | 15368426 | |
| Phosphate de sodium dibasique anhydre | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Pyruvate de sodium | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Filtre à seringue stérile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotomètre | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Agitateur à plaque de titrage | LAB-LINE | 1250 | |
| Pipettes de transfert | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue coloration | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsine du pancréas porcin | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Réactif de blocage universel 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2 % (chlorhydrate de xylazine) | Pet' s Pharma | Q-7972-025 |
Références
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J.
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Réimpressions et autorisations
