Här presenterar vi en sammanställning av analyser för att direkt mäta mitokondriell funktion i däggdjursceller oberoende av deras förmåga att konsumera molekylärt syre.
Flödet av elektroner i mitokondriell elektrontransportkedja (ETC) stöder mångfacetterade biosyntetiska, bioenergetiska och signaleringsfunktioner i däggdjursceller. Eftersom syre (O2) är den mest allestädes närvarande terminala elektronacceptorn för däggdjurets ETC, användsO2-förbrukningshastigheten ofta som en proxy för mitokondriell funktion. Ny forskning visar dock att denna parameter inte alltid indikerar mitokondriell funktion, eftersom fumarat kan användas som en alternativ elektronacceptor för att upprätthålla mitokondriella funktioner vid hypoxi. Denna artikel sammanställer en serie protokoll som gör det möjligt för forskare att mäta mitokondriell funktion oberoende avO2-konsumtionshastigheten. Dessa analyser är särskilt användbara när man studerar mitokondriell funktion i hypoxiska miljöer. Specifikt beskriver vi metoder för att mäta mitokondriell ATP-produktion, de novo pyrimidinbiosyntes, NADH-oxidation genom komplex I och superoxidproduktion. I kombination med klassiska respirometriexperiment kommer dessa ortogonala och ekonomiska analyser att ge forskare en mer omfattande bedömning av mitokondriell funktion i deras intressesystem.
Mitokondriell funktion är ett kritiskt mått på cellulär hälsa, eftersom den upprätthåller viktiga biosyntetiska, bioenergetiska och signalfunktioner i däggdjursceller1. De allra flesta mitokondriella funktioner kräver elektronflöde genom elektrontransportkedjan (ETC), och störningar i elektronflödet i ETC orsakar allvarlig mitokondriell sjukdom2. ETC består av en serie reduktions- och oxidationsreaktioner (redox) som är inbäddade i det inre mitokondriella membranet, och dessa elektronöverföringsreaktioner frigör fri energi som kan utnyttjas för att stödja ATP-syntes, fysiologiska processer såsom termogenes, biosyntetiska vägar såsom de novo pyrimidinbiosyntes och balansen i redoxstatusen för co-faktorer såsom NADH. ETC-komplex I och III producerar reaktiva syreradikaler (ROS)3,4,5, som i sin tur reglerar signaleringsnyckelvägar som HIF, PI3K, NRF2, NFκB och MAPK 6. Följaktligen används metriker av elektronflödet i ETC klassiskt som en proxy för mitokondriell funktion i däggdjursceller.
Respirometriexperiment används ofta för att mäta mitokondriell funktion i däggdjursceller. EftersomO2 är den mest allestädes närvarande terminala elektronacceptorn för däggdjurets ETC, används dess reduktion som en proxy för mitokondriell funktion. Nya bevis visar emellertid att mitokondrier hos däggdjur kan använda fumarat som elektronacceptor för att upprätthålla mitokondriella funktioner som är beroende av ETC, inklusive de novo pyrimidinbiosyntes 7, NADH-oxidation7 och avgiftning av vätesulfid8. I vissa sammanhang, särskilt i hypoxiska miljöer, ger mätningar avO2-konsumtionshastigheten (OCR) således inte en exakt eller exakt indikation på mitokondriell funktion.
Här beskriver vi en serie analyser som kan användas för att mäta mitokondriell funktion oberoende av OCR. Vi tillhandahåller analyser för att direkt mäta komplex I-medierad NADH-oxidation, dihydroorotatdehydrogenasmedierad de novo-pyrimidinbiosyntes, komplex V-beroende ATP-syntes, nettoriktningen för succinatdehydrogenaskomplexet (SDH) och mitokondriell härledd ROS. Dessa analyser är avsedda att utföras på odlade däggdjursceller, även om många kan anpassas för att studera mitokondriella funktioner in vivo. I synnerhet är analyserna som beskrivs i detta protokoll mer direkta mätningar av mitokondriella funktioner än OCR. Dessutom möjliggör de mätning av mitokondriell funktion vid hypoxi, ett sammanhang där OCR inte är en vägledande mätning. Sammantaget kommer dessa analyser, i kombination med klassiska respirometriexperiment, att ge forskare en mer omfattande bedömning av mitokondriell funktion i däggdjursceller.
Eftersom ny forskning visar att mitokondrier hos däggdjur kan fungera utan att konsumera molekylärt syre är det av yttersta vikt för forskare att använda ortogonala analyser, utöver OCR-mätningar, för att exakt kvantifiera mitokondriell funktion. Här sammanställde vi en serie analyser som kan användas för att direkt bedöma aktiviteterna hos komplexa I, komplex II, komplex V och DHODH genom att mäta mitokondriell NAD + / NADH-balans, användningen av adaptiva terminala elektronacceptorer, produktion av ATP, de novo pyrimidinbiosyntes och mitokondriell härledd ROS. I synnerhet mäter dessa analyser mer direkt mitokondriell funktion än OCR-mätningar. Dessutom ger dessa analyser forskare lätthanterliga sätt att kvantifiera mitokondriell funktion under hypoxi, för vilka OCR-mätningar i stort sett är irrelevanta på grund av att fumarat används som den gynnade terminala elektronacceptorn. Slutligen är de spridningsbaserade metoder som beskrivs här mer kostnadseffektiva än klassiska respirometriexperiment, vilket ger ett brett tillgängligt sätt att studera mitokondriell funktion i däggdjurssystem.
Det finns viktiga överväganden när man använder dessa analyser för att mäta mitokondriell funktion i odlade celler. När det gäller proliferationsanalyserna är det viktigt att justera antalet celler som seedas för fördubblingshastigheten för varje cellinje. Cellerna bör sås till minst 10% sammanflöde och med tillräckligt med utrymme för att möjliggöra tre till fyra fördubblingar så att skillnader i proliferation kan kvantifieras. En annan faktor för varje analys är koncentrationen av de små molekyler som används som kontroller för aktiviteterna i varje ETC-komplex. Eftersom olika cellinjer kan uppvisa olika känslighet för dessa hämmare är det viktigt att testa dosen av dessa små molekyler för att identifiera den optimala koncentrationen.
En universell begränsning av analyser som studerar mitokondriell funktion in vitro, inklusive OCR-mätningar och alla analyser som beskrivs här, är odlingsmediets metaboliska sammansättning. Standard cellodlingsmedium tenderar att fördubbla system till ytligt höga nivåer av mitokondriell funktion. Till exempel ökar suprafysiologiska glutaminnivåer sin anapleros av TCA-cykeln25, vilket bränner mitokondriell NADH-syntes och följaktligen ökar oxidativ fosforylering. På liknande sätt varierar partialtrycket av syre mellan 3 mmHg och 100 mmHg (cirka 0,1% -13%O2) i däggdjursvävnader men är atmosfäriskt (140 mmHg, cirka 21%) in vitro26,27. Detta överskottO2 maximerar mitokondriell andningsförmåga och superoxidproduktion28. Nyligen har ansträngningar gjorts för att designa kulturmedier för att vara mer fysiologiska29,30. I synnerhet minskar odling av celler i humana plasmaliknande medier mitokondriell andning i vissa cancercellinjer30, mitokondriell ROS i T-celler 31 och mitokondriella anpassningar till cancerterapi32. Därför är det viktigt att vara uppmärksam på sammansättningen av odlingsmediet som används och förstå hur det kan påverka mitokondriell funktion.
En annan viktig och universell begränsning i tolkningen av mitokondriell funktion är potentialen för skillnader i antalet mitokondrier. Det är därför viktigt att mäta mitokondriellt innehåll genom antingen kvantifiering av mtDNA33, mätning av mitokondriell massa med membranpotentialokänsliga färgämnen34 eller western blotting av mitokondriella markörer. Detta är en kritisk kontroll så att en minskning av antalet mitokondrier inte misstas för en minskning av mitokondriell funktion.
Det finns också specifika begränsningar och felsökning som gäller för de analyser som beskrivs här. För det första, med tanke på att differentierade celler inte prolifererar, kommer de proliferationsbaserade analyserna inte att vara användbara för att bedöma mitokondriell funktion i detta sammanhang. En viktig begränsning i 13C 4-aspartatspårningsprotokollet för att mäta DHODH-aktivitet är att aspartatupptag i celler kan vara extremt ineffektivt35. För att övervinna denna potentiella begränsning kan forskare överuttrycka aspartattransportören, SLC1A3, för att underlätta 13C 4-aspartatupptag35.
En begränsning av protokollet som använder 13C 5-glutaminspårning för att mäta SDH-aktivitet är att denna analys kräver att celler använder den reduktiva karboxyleringsvägen för att berika M + 3-isotopologerna för att mäta omvänd aktivitet. Vissa cellinjer är oförmögna till reduktivt karboxyleringsflöde på grund av lågt ATP-citratlyasuttryck36, otillräcklig HIF-stabilisering 37 eller ett α-KG: citratförhållande som är för lågt38. För att övervinna denna begränsning kan man använda 13C 4-aspartatspårning för att mäta SDH-aktiviteterna framåt och bakåt7. I denna analys kan SDH-framåtaktiviteten mätas med förhållandet fumarat M+2:succinat M+2 och omvänd reaktion med succinat M+4:fumarat M+4. I synnerhet kringgår denna spårning de flesta enzymerna i den reduktiva karboxyleringsvägen.
En begränsning av den komplexa I-aktivitetsanalysen med DCPIP-reduktion som avläsning är att mitokondrierna inte är strukturellt intakta. Processen att frystina mitokondrierna för att möjliggöra deras NADH-upptag för analysen kan säkert skada mitokondriens strukturella integritet39. Denna analys bör utföras parallellt med analyser såsom komplex I-proliferationsanalys för att säkerställa att förändringarna i komplex I-aktivitet som observerats också är sanna med intakta celler.
I framtida studier kan några av dessa tekniker anpassas för att mäta mitokondriella funktioner in vivo med hjälp av modellorganismer som möss och Caenorhabditis elegans. De nuvarande metoderna som används för att mäta mitokondriell funktion in vivo är centrerade på OCR på organismnivå, särskilt andningsväxelkursen vid användning av musmodeller. En tydlig begränsning av denna metod är att syre tjänar många biokemiska och signaleringsfunktioner utöver sin roll som en allestädes närvarande terminal elektronacceptor i mitokondriell ETC. Till exempel “konsumeras” syre av den katalytiska aktiviteten hos enzymer i dioxygenasfamiljen. Även om dessa enzymer bidrar till den cellulära syreförbrukningshastigheten, deltar de inte i, reglerar eller återspeglar mitokondriell funktion. Klassiska respirometriexperiment in vitro kontrollerar vanligtvis för “icke-mitokondriell OCR”, medan organismal respiratorisk utbyteskvot (RER) -experiment inte kan kontrollera för detta, vilket begränsar tolkningen av RER som ett mått för mitokondriell funktion in vivo. Det är dock möjligt att anpassa protokollen för att mäta DHODH-aktivitet via 13 C 4-aspartatspårning, komplex II-aktivitet via 13C5-glutaminspårning, komplex I-aktivitet på mitokondrier renade från vävnader och mitokondriell ROS med LC-MS-vänliga föreningar såsom MitoB för att mäta mitokondriell funktion in vivo . Dessa direkta analyser för att undersöka mitokondriella funktioner, i kombination med klassiska respirometriexperiment, ger forskare en mer omfattande och noggrann bedömning av mitokondriell funktion i däggdjursceller och vävnader.
The authors have nothing to disclose.
Figurerna som produceras i detta manuskript skapades med BioRender.com. Vi är tacksamma för att Amy Walker ger feedback om den här artikeln. J.B.S. stöddes av Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.
1.5 mL tube | Cell Treat | 667443 | |
2.0 mL tube | Cell Treat | 229446 | |
6-well plate | Cell Treat | 229106 | |
12-well plate | Cell Treat | 229112 | |
13C4-aspartate | Sigma-Aldrich | 604852 | |
13C5-Glutamine | Cambridge Isotope Laboratories | 285978-14-5 | |
15 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667411 | |
50 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667421 | |
150 mm tissue culture dish | Cell Treat | 229651 | |
1x Phosphate-buffered saline | Gibco | 10010049 | |
2,6-dichlorophenolindophenol | Honeywell | 33125 | |
Ammonium Carbonate | Sigma-Aldrich | 37999 | |
Antimycin | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascentis Express C18 | Sigma-Aldrich | 53825-U | |
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter | Cell Treat | 229717 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Brequinar | Sigma-Aldrich | SML0113 | |
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade | Cell Treat | 229305 | |
CentriVap -105 Cold Trap | Labconco | 7385020 | |
Complete Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
Coulter Counter Cups | Fisher Scientific | 07-000-694 | |
Decylubiquinone | Sigma-Aldrich | D7911 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Eppendorf Centrifuge 5425R | Eppendorf | 2231000908 | |
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri | Eppendorf | 5943000343 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glucose-free DMEM | Gibco | 11966025 | |
Glutamine-free DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide | Thermo Scientific | 460801000 | |
HPLC-grade Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 900667 | |
HPLC-grade Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
HPLC-grade formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
HPLC-grade Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | |
HPLC-grade MeOH | Sigma-Aldrich | 900688 | |
HPLC-grade Water | Sigma-Aldrich | 270733 | |
Human Osteosarcome Cell Line 143B | ATCC | CRL-8303 | |
Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | |
Isotone buffer | Beckman Coulter | 8546719 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P2222 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
MitoSox Red | Invitrogen | M36008 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
Pencillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 | Kimble | 885502-0021 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Pyruvate-free DMEM media | Gibco | 11965175 | |
Q Exactive Plus Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 726030 | |
ReCO2ver Incubator | Baker | ||
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7310020 | |
RIPA Buffer | Millipore Sigma | 20188 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column | Sigma-Aldrich | 1.50460.0001 | |
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit | Millipore Sigma | 1.50438.0001 | |
Sodium Hydroxide, Pellets | Millipore Sigma | 567530-250GM | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 | Thermo Scientific | OPTON-31001 | |
Tert-butyl hydroperoxide solution | Sigma-Aldrich | 458139 | |
Tris | Sigma-Aldrich | 93352 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25-200-114 | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC | Thermo Scientific | VF-S01-A-02 | |
Z2 Coulter Particle count and size analyzer | Beckman Coulter | BZ10131270 |