Et antimikrobielt stof ved hjælp af nano-urteindkapsling af æteriske olier
Summary
Antimikrobielle laboratoriebelægninger forhindrer krydskontaminering af patogenakkumulering og utilsigtet bioudslip. Her beskriver vi protokollen for udvikling af et hudvenligt antimikrobielt stof ved hjælp af nano-urteindkapsling og modificerede standardtests for præcist at evaluere effektiviteten og egnetheden til typisk brug af laboratoriefrakken.
Abstract
Labcoats bruges i vid udstrækning i biohazard laboratorier og sundhedsfaciliteter som beskyttelsesbeklædning for at forhindre direkte eksponering for patogener, spild og forbrændinger. Disse bomuldsbaserede beskyttelseslag giver ideelle betingelser for mikrobiel vækst og fastgørelsessteder på grund af deres porøse natur, fugtholdende kapacitet og tilbageholdelse af varme fra brugerens krop. Flere undersøgelser har vist overlevelsen af patogene bakterier på hospitalsbeklædning og laboratoriefrakker, der fungerer som vektorer for mikrobiel transmission.
En almindelig tilgang til at løse disse problemer er anvendelsen af antimikrobielle midler i tekstilfinish, men der er blevet rejst bekymring på grund af toksiciteten og miljøvirkningerne af mange syntetiske kemikalier. Den igangværende pandemi har også åbnet et vindue for undersøgelse af effektive antimikrobielle stoffer og miljøvenlige og giftfrie formuleringer. Denne undersøgelse bruger to naturlige bioaktive forbindelser, carvacrol og thymol, indkapslet i chitosan nanopartikler, som garanterer effektiv beskyttelse mod fire humane patogener med op til en 4-log reduktion (99,99%). Disse patogener påvises ofte i laboratoriebelægninger, der anvendes i biohazard laboratorier.
De behandlede stoffer modstod også op til 10 vaskecyklusser med 90% mikrobiel reduktion, hvilket er tilstrækkeligt til den tilsigtede anvendelse. Vi har foretaget ændringer af de eksisterende standardstoftests for bedre at repræsentere de typiske scenarier for brug af laboratoriebelægning. Disse forbedringer giver mulighed for en mere nøjagtig evaluering af effektiviteten af antimikrobielle laboratoriebelægninger og for simulering af skæbnen for ethvert utilsigtet mikrobielt spild, der skal neutraliseres inden for kort tid. Yderligere undersøgelser anbefales for at undersøge akkumuleringen af patogener over tid på antimikrobielle laboratoriefrakker sammenlignet med almindelige beskyttelseslag.
Introduction
Den beskyttende hvide frakke er et obligatorisk personligt beskyttelsesudstyr (PPE) i mikrobiologiske laboratorier og sundhedsfaciliteter, og det beskytter mod direkte eksponering for patogener, spild og forbrændinger. Disse bomuldsfrakker fremmer mikrobiel vækst på grund af mange faktorer – det vævede stof giver fastgørelsessteder og beluftning, bomuld og stivelse, der anvendes i fremstillingsprocessen sammen med eksfolierede epitelceller fra brugeren, leverer næringsstoffer, og nærheden til brugeren giver varme og fugt. Akkumuleringen af mikrober på tekstiler kan også forårsage sundhedsmæssige problemer såsom allergier og nosokomiel infektion, ubehagelig lugt og stofforringelse1.
I modsætning til almindeligt tøj vaskes eller desinficeres beskyttelsesfrakker sjældent, som det findes i mange undersøgelser 2,3. Mange undersøgelser viser tegn på, at laboratoriefrakker fungerer som en vektor for mikrobiel transmission og risikoen for nosokomielle infektioner i sundhedsvæsenet2,4, især resistente stammer3 såsom methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA); De giver således anledning til sundhedsmæssige betænkeligheder ved personlige værnemidler, som er beregnet til at beskytte mod mikrobiel kontaminering. Der er ikke nok tværsnitsundersøgelser af laboratoriecoat-associerede infektioner i forbindelse med Biosafety Level 2 (BSL-2) faciliteter eller mikrobiologiske undervisningslaboratorier, men mange regulerende myndigheder begrænser brugen af laboratoriefrakker inden for indeslutningsniveauet. Imidlertid kæmper mange akademiske institutioner i Nordamerika for at opfylde kravene på grund af praktiske begrænsninger, såsom hvidvaskning og opbevaring inde i anlægget, hændelserne med at bære laboratoriefrakker i offentlige områder som cafeterier og biblioteker er almindelige. En praktisk løsning på disse problemer er anvendelsen af antimikrobielle midler i tekstilfinish.
Antimikrobielle stoffer vinder stigende popularitet i sportstøj, aktivt tøj og sokker, primært beregnet til at reducere kropslugt. Imidlertid er brugen af disse stoffer ikke almindelig i PPE-udvikling, bortset fra nogle sølvbelagte bomuldsmasker og sundhedsbeklædning5. Vi rapporterer udviklingen af et antimikrobielt stof til laboratoriefrakker, som hæmmer almindelige patogener, der findes i BSL-2-laboratorier og yder effektiv beskyttelse mod krydskontaminering af almindelige patogener.
I øjeblikket er der en række antimikrobielle stoffer og efterbehandlingsmidler tilgængelige på markedet, men de fleste af disse bruger kolloide tungmetalpartikler (f.eks. sølv, kobber, zink), organometallik eller syntetiske kemikalier såsom triclosan og kvaternære ammoniumforbindelser, som ikke er miljøvenlige1 og kan føre til sundhedsmæssige problemer såsom hudirritation og allergi6. Nogle syntetiske formuleringer giver anledning til bekymring på grund af mikrober uden for målgruppen, såsom normal flora eller inducerende antimikrobiel resistens (AMR). Den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) regulerer kommercielle antimikrobielle stoffer, som skal være ikke-giftige for brugeren og fri for økotoksicitet. Derfor foretrækkes antimikrobielle stoffer baseret på naturlige biocider, der hæmmer et bredt spektrum af mikrober. Æteriske olier (EO’er) anvendes bredt som antimikrobielle og terapeutiske midler, men deres anvendelse i antimikrobiel efterbehandling er begrænset på grund af deres holdbarhed 6,7,8. Baseret på vores viden og markedsundersøgelser om nano-urte efterbehandling8, ingen urtebaserede antimikrobielle stof er kommercielt tilgængelige. Dette skyldes, at syntetiske belægninger er nemme at fremstille og har lang holdbarhed. Et par nano-urtebelagte tekstiler, der kun rapporteres til forskningsformål, omfatter neem7, moringa 9 og karryblade9.
Denne undersøgelse bruger to bioaktive komponenter ekstraheret fra oregano EO’er, carvacrol og thymol, som er effektive mod en bred vifte af bakterielle patogener og vira, men er generelt anerkendt som sikre for mennesker10. Disse bioaktive komponenter er imidlertid flygtige, og derfor er deres antimikrobielle potentiale kortvarigt, hvis de påføres direkte på stoffet. Nano-urteindkapsling er en proces, hvor bioaktive komponenter eller lægemidler indlæses inde i en polymer skal, der beskytter kernen mod miljøforringelse og dermed forbedrer holdbarheden. Derudover forbedrer den lille størrelse af de polymere partikler, som generelt varierer fra 10 nm til 100 nm, effektiviteten af applikationen og bremser frigivelsen af de bioaktive forbindelser på stoffet. Disse bioaktive forbindelser anvendes til forskellige formål, såsom konservering af fødevarer10, men ikke til tekstilbelægning.
Blandt mange polymere indkapslingsmidler er chitosan en attraktiv kandidat på grund af mange af dets egenskaber, såsom ikke-toksicitet, bionedbrydelighed, mucoadhæsivitet og biokompatibilitet11. Det er et naturligt polysaccharid, opnået ved deacetyleringsprocessen fra chitin, som findes i muslingeskaller og svampecellevægge. Det bruges i biokemiske og fødevarekonserverende applikationer såsom lægemiddel- eller proteinafgivelse 11,12,13, kontrolleret frigivelse 14 og antimikrobielle film 10. Chitosan er ikke let opløseligt i vand, men danner en kolloid suspension i sure medier. Bioaktive molekyler indlæses i chitosan nanopartikler (NP’er) ved en simpel to-trins ionisk geleringsmetode14,15,16. I denne proces danner hydrofobe bioaktive forbindelser såsom carvacrol og thymol en olie-i-vand-emulsion, som hjælpes af et overfladeaktivt middel, Tween 80. Derefter anvendes en polyanionforbindelse, pentanatriumtripolyphosphat (TPP), til dannelse af tværbindingerne mellem aminogrupperne langs de polykationiske polymermolekyler og phosphatgrupper af TPP-molekyler for at stabilisere komplekset. Denne kompleksdannelsesproces størkner de bioaktive forbindelser i chitosanmatrixen, som efterfølgende renses og overtrækkes på bomuldsprøver for at producere antimikrobielt stof.
Nanoformuleringerne skal først testes for antimikrobiel effektivitet i emulsionsform, før de påføres stoffet. Dette kan bekvemt evalueres ved en kvalitativ metode, såsom Kirby-Bauer diskdiffusion, brønddiffusion og cylinderpladeanalysen. Imidlertid giver cylinderpladeanalysen17 fleksibiliteten til at indlæse forskellige volumener af formuleringen og sammenligne frigangszonen. I denne metode lægges de antimikrobielle formuleringer i cylindre af rustfrit stål og anbringes på et blødt agarlag, som inokuleres med testmikroorganismen eller patogenet. Diameteren af clearance produceret mod testorganismen er proportional med den antimikrobielle formulerings hæmmende potentiale og kan derfor anvendes som et alternativ til bouillonfortyndingsmetoder. Størrelsen af de klare zoner er imidlertid kun et komparativt eller kvalitativt mål inden for en bestemt plade, medmindre specifikke standarder opretholdes. Antimikrobielle midler virker mod patogenerne enten ved at hæmme deres vækst (biostatisk) eller dræbe cellerne (biocid), som kan kvantificeres ved henholdsvis minimum hæmmende koncentration (MIC) og minimum bakteriedræbende koncentration (MBC). Imidlertid er effektiviteten og adfærden af de bioaktive kemikalier forskellige i deres formuleringer (flydende tilstand) og når de overtrækkes på et substrat såsom et stof18. Dette skyldes, at flere faktorer spiller en rolle i effektiviteten, såsom stabiliteten af de antimikrobielle midlers vedhæftning til stoffet, fugtindhold, substrattype og vedhæftning af mikroberne. Hvis det tilsigtede formål kun er bakteriostatisk aktivitet, kan et kvalitativt assay som “Parallel Streak Method”19 give en relativt hurtig og nem evaluering af diffusibel antimikrobiel formulering. Men hvis de bakteriedræbende virkninger skal bestemmes, kan “Vurdering af antibakterielle overflader på tekstilmaterialer”20 anvendes, hvilket giver logreduktionen af det spikede patogen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biocidernes antimikrobielle effekt testes konventionelt ved kvantitative assays, såsom minimum hæmmende koncentration (MIC) og minimum bakteriedræbende koncentration (MBC), hvor bakterierne nedsænkes i en antimikrobiel væske i 24 timer. Disse analyser er imidlertid ikke egnede til coatede stoffer, hvor væskegrænsefladen mangler, og biociderne diffunderes langsomt langs stoffibrene. Derfor er der etableret mange standardstoftest, såsom AATCC 147, ISO 20645, AATCC 100 og JIS L 1902. En sammenligningsundersøgelse a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev finansieret af “Applied Research, Innovation and Entrepreneurship Services” (ARIES), Centennial College, Canada.
Materials
| Acetic acid | Millipore Sigma | 64-19-7 | |
| Antibiotic base agar | BD Difco | DF0270-17-4 | Also known as Antibiotic Medium 2 |
| Antibiotic seed agar | BD Difco | DF0263-17-3 | Also known as Antibiotic Medium 1 |
| Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood) | Donated by CFIA | ||
| Bromcresol Purple Lactose Agar | Donated by CFIA | ||
| Candida albicans | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 10231 | |
| Carvacrol | Millipore Sigma | 282197 (CAS# 499-75-2) | |
| Centrifuge Allergra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | Model # X-22R | Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time. |
| Chitosan Medium Molecular Weight (CS) | Millipore Sigma | 448877 (CAS # 9012-76-4) | |
| Clamshell Heat Press | Intiva | IM1200 | |
| Escherichia coli (E. coli) | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 23725 | |
| Incubator | Thermo Scientific | 1205M34 | |
| Letheen Broth | BD Difco | DF0681-17-7 | Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product. |
| Milli Q water | Millipore Sigma | ZR0Q16WW | Deionized water |
| Mueller-Hinton Agar | BD Difco | DF0252-17-6 | |
| Pentasodium tripolyphosphate (TPP) | Millipore Sigma | 238503 (CAS# 7758-29-4) | |
| Phospahte Buffered Saline (PBS) | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 9027 | |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD Difco | DF0109-17-1 | |
| Shaking incubator/ Thermo shaker | VWR | Model# SHKA2000 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 6538 | |
| Thymol | Millipore Sigma | T0501 (CAS# 89-83-8) | |
| Trypticase Soy Agar | BD Difco | 236950 | |
| Trypticase Soy Broth | BD Difco | 215235 | |
| Tween 80 | Millipore Sigma | STS0204 (CAS # 9005-65-6) | |
| UV-Vis Spectrophometer | Thermo Scientific | GENESYS 30 (840-277000) |
References
- Schmidt-Emrich, S., et al. Rapid assay to assess bacterial adhesion on textiles. Materials. 9 (4), 249 (2016).
- Qaday, J., et al. Bacterial contamination of medical doctors and students white coats at Kilimanjaro Christian Medical Centre, Moshi, Tanzania. International Journal of Bacteriology. 2015, 507890 (2015).
- Treakle, A. M., et al. Bacterial contamination of health care workers’ white coats. American Journal of Infection Control. 37 (2), 101-105 (2009).
- Wong, D., Nye, K., Hollis, P. Microbial flora on doctors’ white coats. BMJ. 303 (6817), 1602-1604 (1991).
- Gouveia, I. C. Nanobiotechnology: A new strategy to develop non-toxic antimicrobial textiles for healthcare applications. Journal of Biotechnology. (150), 349 (2010).
- Joshi, M., Ali, S. W., Purwar, R., Rajendran, S. Ecofriendly antimicrobial finishing of textiles using bioactive agents based on natural products. Indian Journal of Fibre and Textile Research. 34, 295-304 (2009).
- Ahmed, H. A., Rajendran, R., Balakumar, C. Nanoherbal coating of cotton fabric to enhance antimicrobial durability. Elixir Applied Chemistry. 45, 7840-7843 (2012).
- Morais, D. S., Guedes, R. M., Lopes, M. A. Antimicrobial approaches for textiles: From research to market. Materials. 9 (6), 498 (2016).
- Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Development of advanced textile finishes using nano-emulsions from herbal extracts for organic cotton fabrics. Coatings. 11 (8), 939 (2021).
- Martínez-Hernández, G. B., Amodio, M. L., Colelli, G. Carvacrol-loaded chitosan nanoparticles maintain quality of fresh-cut carrots. Innovative Food Science & Emerging Technologies. 41, 56-63 (2017).
- Zhang, H. L., Wu, S. H., Tao, Y., Zang, L. Q., Su, Z. Q. Preparation and characterization of water-soluble chitosan nanoparticles as protein delivery system. Journal of Nanomaterials. 2010, 1-5 (2010).
- Patel, R., Gajra, B., Parikh, R. H., Patel, G. Ganciclovir loaded chitosan nanoparticles: preparation and characterization. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology. 7 (6), 1-8 (2016).
- Merodio, M., Arnedo, A., Renedo, M. J., Irache, J. M. Ganciclovir-loaded albumin nanoparticles: characterization and in vitro release properties. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 251-259 (2001).
- Hsieh, W. C., Chang, C. P., Gao, Y. L. Controlled release properties of Chitosan encapsulated volatile Citronella Oil microcapsules by thermal treatments. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 53 (2), 209-214 (2006).
- Yoksan, R., Jirawutthiwongchai, J., Arpo, K. Encapsulation of ascorbyl palmitate in chitosan nanoparticles by oil-in-water emulsion and ionic gelation processes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 76 (1), 292-297 (2010).
- Keawchaoon, L., Yoksan, R. Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 84 (1), 163-171 (2011).
- Cazedey, E. C. L., Salgado, H. R. N. Development and validation of a microbiological agar assay for determination of orbifloxacin in pharmaceutical preparations. Pharmaceutics. 3 (3), 572-581 (2011).
- Jayapriya, S., Bagyalakshmi, G. Textile antimicrobial testing and standards. International Journal of Textile and Fashion Technology. 4 (1), 2250-2378 (2013).
- AATCC 100. Antibacterial Finishes on Textile Materials: Assessment of Developed from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 100. , (2004).
- AATCC 147. Antimicrobial Activity Assessment of Textile Materials: Parallel Streak Method from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 147. , (2004).
- Ortelli, S., Costa, A. L., Dondi, M. TiO2 nanosols applied directly on textiles using different purification treatments. Materials. 8 (11), 7988-7996 (2015).
- Poole, K. Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max. Frontiers in Microbiology. 2, 65 (2011).
- Pinho, E., Magalhães, L., Henriques, M., Oliveira, R. Antimicrobial activity assessment of textiles: standard methods comparison. Annals of Microbiology. 61 (3), 493-498 (2010).
- Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Novel antimicrobial finishing of organic cotton fabrics using nano-emulsions derived from Karanja and Gokhru plants. Textile Research Journal. 92 (23-24), 5015-5032 (2022).
