Een antimicrobiële stof met behulp van nano-kruiden inkapseling van essentiële oliën
Summary
Antimicrobiële laboratoriumjassen voorkomen kruisbesmetting van accumulatie van ziekteverwekkers en accidentele bio-spills. Hier beschrijven we het protocol voor het ontwikkelen van een huidvriendelijke antimicrobiële stof met behulp van nano-kruideninkapseling en aangepaste standaardtests om de werkzaamheid en geschiktheid voor typisch gebruik van de laboratoriumjas nauwkeurig te evalueren.
Abstract
Laboratoriumjassen worden veel gebruikt in biohazard-laboratoria en zorginstellingen als beschermende kleding om directe blootstelling aan ziekteverwekkers, morsen en brandwonden te voorkomen. Deze op katoen gebaseerde beschermende jassen bieden ideale omstandigheden voor microbiële groei en aanhechtingsplaatsen vanwege hun poreuze aard, vochtvasthoudend vermogen en het vasthouden van warmte uit het lichaam van de gebruiker. Verschillende studies hebben de overleving van pathogene bacteriën op ziekenhuiskleding en laboratoriumjassen aangetoond, die fungeren als vectoren van microbiële transmissie.
Een gemeenschappelijke aanpak om deze problemen op te lossen is de toepassing van antimicrobiële stoffen in textielafwerking, maar er zijn zorgen geuit vanwege de toxiciteit en milieueffecten van veel synthetische chemicaliën. De aanhoudende pandemie heeft ook een venster geopend voor het onderzoek naar effectieve antimicrobiële stoffen en milieuvriendelijke en toxiciteitsvrije formuleringen. Deze studie maakt gebruik van twee natuurlijke bioactieve verbindingen, carvacrol en thymol, ingekapseld in chitosan nanodeeltjes, die een effectieve bescherming garanderen tegen vier menselijke pathogenen met een reductie tot 4 log (99,99%). Deze pathogenen worden vaak gedetecteerd in laboratoriumjassen die worden gebruikt in biohazard-laboratoria.
De behandelde stoffen waren ook bestand tegen maximaal 10 wascycli met 90% microbiële reductie, wat voldoende is voor het beoogde gebruik. We hebben wijzigingen aangebracht in de bestaande standaard stoftests om de typische scenario’s van laboratoriumjasgebruik beter weer te geven. Deze verfijningen maken een nauwkeurigere evaluatie van de effectiviteit van antimicrobiële laboratoriumjassen mogelijk en voor de simulatie van het lot van eventuele accidentele microbiële lozingen die binnen korte tijd moeten worden geneutraliseerd. Verdere studies worden aanbevolen om de accumulatie van pathogenen in de loop van de tijd op antimicrobiële laboratoriumjassen te onderzoeken in vergelijking met reguliere beschermende jassen.
Introduction
De beschermende witte jas is een verplicht item voor persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) in microbiologische laboratoria en zorginstellingen en beschermt tegen directe blootstelling aan ziekteverwekkers, morsen en brandwonden. Deze katoenen jassen bevorderen microbiële groei als gevolg van vele factoren – de geweven stof biedt bevestigingsplaatsen en beluchting, katoen en zetmeel gebruikt in het productieproces samen met geëxfolieerde epitheelcellen van de gebruiker leveren voedingsstoffen, en de nabijheid van de gebruiker geeft warmte en vocht. De ophoping van microben op textiel kan ook gezondheidsproblemen veroorzaken, zoals allergieën en nosocomiale infecties, onaangename geuren en verslechtering van de stof1.
In tegenstelling tot gewone kleding worden beschermende jassen niet vaak gewassen of gedesinfecteerd, zoals in veel onderzoeken 2,3. Veel studies tonen bewijs van laboratoriumjassen die fungeren als een vector van microbiële transmissie en het risico op nosocomiale infecties in de gezondheidszorg2,4, met name resistente stammen3 zoals methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA); ze roepen dus gezondheidsproblemen op van PBM, die bedoeld zijn om te beschermen tegen microbiële besmetting. Er zijn niet genoeg cross-sectionele studies over laboratoriumjas-geassocieerde infecties in de context van Biosafety Level 2 (BSL-2) faciliteiten of microbiologische onderwijslaboratoria, maar veel regelgevende instanties beperken het gebruik van laboratoriumjassen binnen het containmentniveau. Veel academische instellingen in Noord-Amerika hebben echter moeite om aan de vereisten te voldoen vanwege praktische beperkingen, zoals het wassen en opslaan in de faciliteit, de incidenten van het dragen van laboratoriumjassen in openbare ruimtes zoals cafetaria’s en bibliotheken komen vaak voor. Een praktische oplossing voor deze problemen is de toepassing van antimicrobiële stoffen in textielafwerking.
Antimicrobiële stoffen winnen steeds populairder in sportkleding, activewear en sokken, voornamelijk bedoeld om lichaamsgeur te verminderen. Het gebruik van deze stoffen is echter niet gebruikelijk bij de ontwikkeling van PBM’s, met uitzondering van sommige met zilver gecoate katoenen maskers en kleding voor de gezondheidszorg5. We rapporteren de ontwikkeling van een antimicrobieel weefsel voor laboratoriumjassen, dat veel voorkomende pathogenen in BSL-2-laboratoria remt en effectieve bescherming biedt tegen de kruisbesmetting van veel voorkomende pathogenen.
Momenteel zijn er verschillende antimicrobiële stoffen en afwerkingen op de markt, maar de meeste hiervan gebruiken colloïdale deeltjes van zware metalen (bijv. Zilver, koper, zink), organometaal of synthetische chemicaliën zoals triclosan en quaternaire ammoniumverbindingen, die niet milieuvriendelijk zijn1 en kunnen leiden tot gezondheidsproblemen zoals huidirritatie en allergieën6. Sommige synthetische formuleringen vormen zorgwekkend vanwege niet-doelmicroben, zoals normale flora of het induceren van antimicrobiële resistentie (AMR). De Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) reguleert commerciële antimicrobiële stoffen, die niet-toxisch moeten zijn voor de gebruiker en vrij van ecotoxiciteit. Daarom hebben antimicrobiële stoffen op basis van natuurlijke biociden die een breed spectrum van microben remmen de voorkeur. Essentiële oliën (EO’s) worden veel gebruikt als antimicrobiële en therapeutische middelen, maar hun gebruik in antimicrobiële afwerking is beperkt vanwege hun duurzaamheid 6,7,8. Op basis van onze kennis en marktonderzoek naar nano-kruidenafwerking8, is er geen op kruiden gebaseerde antimicrobiële stof in de handel verkrijgbaar. Dit komt omdat synthetische coatings gemakkelijk te produceren zijn en een lange levensduur hebben. Een paar nano-kruiden gecoate textiel alleen gerapporteerd voor onderzoeksdoeleinden omvatten neem7, moringa 9 en curry bladeren9.
De huidige studie maakt gebruik van twee bioactieve componenten geëxtraheerd uit oregano EO’s, carvacrol en thymol, die effectief zijn tegen een breed scala aan bacteriële pathogenen en virussen, maar over het algemeen worden erkend als veilig voor mensen10. Deze bioactieve componenten zijn echter vluchtig en daarom is hun antimicrobiële potentieel van korte duur als ze rechtstreeks op de stof worden aangebracht. Nano-kruiden inkapseling is een proces waarbij bioactieve componenten of geneesmiddelen worden geladen in een polymere schaal die de kern beschermt tegen aantasting van het milieu en zo de houdbaarheid verbetert. Bovendien verbetert de kleine omvang van de polymere deeltjes, die over het algemeen variëren van 10 nm tot 100 nm, de werkzaamheid van de toepassing en vertraagt het de afgifte van de bioactieve stoffen op het weefsel. Deze bioactieve stoffen worden gebruikt voor verschillende doeleinden, zoals voedselconservering10, maar niet voor textielcoating.
Onder veel polymere inkapselaars is chitosan een aantrekkelijke kandidaat vanwege veel van zijn kenmerken, zoals niet-toxiciteit, biologische afbreekbaarheid, mucoadhesiviteit en biocompatibiliteit11. Het is een natuurlijke polysaccharide, verkregen door het deacetyleringsproces van chitine, dat wordt aangetroffen in schelpen en schimmelcelwanden. Het wordt gebruikt in biochemische en voedselconserveringstoepassingen zoals medicijn- of eiwitafgifte 11,12,13, gecontroleerde afgifte 14 en antimicrobiële films 10. Chitosan is niet gemakkelijk oplosbaar in water, maar vormt een colloïdale suspensie in zure media. Bioactieve moleculen worden geladen in chitosan nanodeeltjes (NP’s) door een eenvoudige tweestaps ionische gelatiemethode14,15,16. In dit proces vormen hydrofobe bioactieve stoffen zoals carvacrol en thymol een olie-in-water-emulsie, die wordt geholpen door een oppervlakteactieve stof, Tween 80. Vervolgens wordt een polyanionische verbinding, pentanatriumtripolyfosfaat (TPP), gebruikt om de dwarsverbindingen te vormen tussen de aminogroepen langs de polycationische polymeermoleculen en fosfaatgroepen van TPP-moleculen om het complex te stabiliseren. Dit complexatieproces stolt de bioactieve stoffen in de matrix van chitosan, die vervolgens wordt gezuiverd en gecoat op katoenen stalen om antimicrobieel weefsel te produceren.
De nanoformuleringen moeten eerst worden getest op antimicrobiële effectiviteit in emulsievorm voordat ze op de stof worden aangebracht. Dit kan gemakkelijk worden geëvalueerd met een kwalitatieve methode, zoals Kirby-Bauer schijfdiffusie, putdiffusie en de cilinderplaattest. De cilinderplaattest17 biedt echter de flexibiliteit om verschillende volumes van de formulering te laden en de vrije zone te vergelijken. Bij deze methode worden de antimicrobiële formuleringen geladen in roestvrijstalen cilinders en op een zachte agarlaag geplaatst, die wordt ingeënt met het testmicro-organisme of pathogeen. De diameter van de klaringszone die tegen het testorganisme wordt geproduceerd, is evenredig met het remmende potentieel van de antimicrobiële formulering en kan daarom worden gebruikt als alternatief voor bouillonverdunningsmethoden. De grootte van de vrije zones is echter slechts een vergelijkende of kwalitatieve maat binnen een specifieke plaat, tenzij specifieke normen worden gehandhaafd. Antimicrobiële stoffen werken tegen de ziekteverwekkers door hun groei te remmen (biostatisch) of door de cellen te doden (biocide), wat kan worden gekwantificeerd door respectievelijk minimale remmende concentratie (MIC) en minimale bacteriedodende concentratie (MBC). De werkzaamheid en het gedrag van de bioactieve chemicaliën zijn echter verschillend in hun formuleringen (vloeibare toestand) en wanneer ze zijn gecoat op een substraat zoals een stof18. Dit komt omdat meerdere factoren een rol spelen in de werkzaamheid, zoals de stabiliteit van de hechting van de antimicrobiële middelen aan de stof, vochtgehalte, substraattype en hechting van de microben. Als het beoogde doel alleen bacteriostatische activiteit is, kan een kwalitatieve test zoals de “Parallel Streak Method”19 een relatief snelle en eenvoudige evaluatie van diffuseerbare antimicrobiële formulering opleveren. Als echter de bacteriedodende effecten moeten worden bepaald, kan “Beoordeling van antibacteriële afwerkingen op textielmaterialen”20 worden gebruikt, wat de logreductie van de spiked pathogeen oplevert.
Protocol
Representative Results
Discussion
De antimicrobiële werkzaamheid van biociden wordt conventioneel getest door middel van kwantitatieve assays, zoals minimale remmende concentratie (MIC) en minimale bacteriedodende concentratie (MBC), waarbij de bacteriën gedurende 24 uur worden ondergedompeld in een antimicrobiële vloeistof. Deze testen zijn echter niet geschikt voor gecoate weefsels, waarbij de vloeibare interface ontbreekt en de biociden langzaam langs de weefselvezels worden verspreid. Daarom zijn er veel standaard stoftests vastgesteld, zoals AATC…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door “Applied Research, Innovation and Entrepreneurship Services” (ARIES), Centennial College, Canada.
Materials
| Acetic acid | Millipore Sigma | 64-19-7 | |
| Antibiotic base agar | BD Difco | DF0270-17-4 | Also known as Antibiotic Medium 2 |
| Antibiotic seed agar | BD Difco | DF0263-17-3 | Also known as Antibiotic Medium 1 |
| Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood) | Donated by CFIA | ||
| Bromcresol Purple Lactose Agar | Donated by CFIA | ||
| Candida albicans | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 10231 | |
| Carvacrol | Millipore Sigma | 282197 (CAS# 499-75-2) | |
| Centrifuge Allergra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | Model # X-22R | Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time. |
| Chitosan Medium Molecular Weight (CS) | Millipore Sigma | 448877 (CAS # 9012-76-4) | |
| Clamshell Heat Press | Intiva | IM1200 | |
| Escherichia coli (E. coli) | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 23725 | |
| Incubator | Thermo Scientific | 1205M34 | |
| Letheen Broth | BD Difco | DF0681-17-7 | Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product. |
| Milli Q water | Millipore Sigma | ZR0Q16WW | Deionized water |
| Mueller-Hinton Agar | BD Difco | DF0252-17-6 | |
| Pentasodium tripolyphosphate (TPP) | Millipore Sigma | 238503 (CAS# 7758-29-4) | |
| Phospahte Buffered Saline (PBS) | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 9027 | |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD Difco | DF0109-17-1 | |
| Shaking incubator/ Thermo shaker | VWR | Model# SHKA2000 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 6538 | |
| Thymol | Millipore Sigma | T0501 (CAS# 89-83-8) | |
| Trypticase Soy Agar | BD Difco | 236950 | |
| Trypticase Soy Broth | BD Difco | 215235 | |
| Tween 80 | Millipore Sigma | STS0204 (CAS # 9005-65-6) | |
| UV-Vis Spectrophometer | Thermo Scientific | GENESYS 30 (840-277000) |
References
- Schmidt-Emrich, S., et al. Rapid assay to assess bacterial adhesion on textiles. Materials. 9 (4), 249 (2016).
- Qaday, J., et al. Bacterial contamination of medical doctors and students white coats at Kilimanjaro Christian Medical Centre, Moshi, Tanzania. International Journal of Bacteriology. 2015, 507890 (2015).
- Treakle, A. M., et al. Bacterial contamination of health care workers’ white coats. American Journal of Infection Control. 37 (2), 101-105 (2009).
- Wong, D., Nye, K., Hollis, P. Microbial flora on doctors’ white coats. BMJ. 303 (6817), 1602-1604 (1991).
- Gouveia, I. C. Nanobiotechnology: A new strategy to develop non-toxic antimicrobial textiles for healthcare applications. Journal of Biotechnology. (150), 349 (2010).
- Joshi, M., Ali, S. W., Purwar, R., Rajendran, S. Ecofriendly antimicrobial finishing of textiles using bioactive agents based on natural products. Indian Journal of Fibre and Textile Research. 34, 295-304 (2009).
- Ahmed, H. A., Rajendran, R., Balakumar, C. Nanoherbal coating of cotton fabric to enhance antimicrobial durability. Elixir Applied Chemistry. 45, 7840-7843 (2012).
- Morais, D. S., Guedes, R. M., Lopes, M. A. Antimicrobial approaches for textiles: From research to market. Materials. 9 (6), 498 (2016).
- Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Development of advanced textile finishes using nano-emulsions from herbal extracts for organic cotton fabrics. Coatings. 11 (8), 939 (2021).
- Martínez-Hernández, G. B., Amodio, M. L., Colelli, G. Carvacrol-loaded chitosan nanoparticles maintain quality of fresh-cut carrots. Innovative Food Science & Emerging Technologies. 41, 56-63 (2017).
- Zhang, H. L., Wu, S. H., Tao, Y., Zang, L. Q., Su, Z. Q. Preparation and characterization of water-soluble chitosan nanoparticles as protein delivery system. Journal of Nanomaterials. 2010, 1-5 (2010).
- Patel, R., Gajra, B., Parikh, R. H., Patel, G. Ganciclovir loaded chitosan nanoparticles: preparation and characterization. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology. 7 (6), 1-8 (2016).
- Merodio, M., Arnedo, A., Renedo, M. J., Irache, J. M. Ganciclovir-loaded albumin nanoparticles: characterization and in vitro release properties. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 251-259 (2001).
- Hsieh, W. C., Chang, C. P., Gao, Y. L. Controlled release properties of Chitosan encapsulated volatile Citronella Oil microcapsules by thermal treatments. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 53 (2), 209-214 (2006).
- Yoksan, R., Jirawutthiwongchai, J., Arpo, K. Encapsulation of ascorbyl palmitate in chitosan nanoparticles by oil-in-water emulsion and ionic gelation processes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 76 (1), 292-297 (2010).
- Keawchaoon, L., Yoksan, R. Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 84 (1), 163-171 (2011).
- Cazedey, E. C. L., Salgado, H. R. N. Development and validation of a microbiological agar assay for determination of orbifloxacin in pharmaceutical preparations. Pharmaceutics. 3 (3), 572-581 (2011).
- Jayapriya, S., Bagyalakshmi, G. Textile antimicrobial testing and standards. International Journal of Textile and Fashion Technology. 4 (1), 2250-2378 (2013).
- AATCC 100. Antibacterial Finishes on Textile Materials: Assessment of Developed from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 100. , (2004).
- AATCC 147. Antimicrobial Activity Assessment of Textile Materials: Parallel Streak Method from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 147. , (2004).
- Ortelli, S., Costa, A. L., Dondi, M. TiO2 nanosols applied directly on textiles using different purification treatments. Materials. 8 (11), 7988-7996 (2015).
- Poole, K. Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max. Frontiers in Microbiology. 2, 65 (2011).
- Pinho, E., Magalhães, L., Henriques, M., Oliveira, R. Antimicrobial activity assessment of textiles: standard methods comparison. Annals of Microbiology. 61 (3), 493-498 (2010).
- Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Novel antimicrobial finishing of organic cotton fabrics using nano-emulsions derived from Karanja and Gokhru plants. Textile Research Journal. 92 (23-24), 5015-5032 (2022).
