Un tessuto antimicrobico che utilizza l'incapsulamento nano-erboristico di oli essenziali

Summary

I camici da laboratorio antimicrobici prevengono la contaminazione incrociata dell’accumulo di agenti patogeni e delle fuoriuscite accidentali di sostanze biologiche. Qui, descriviamo il protocollo per lo sviluppo di un tessuto antimicrobico delicato sulla pelle utilizzando l’incapsulamento nano-a base di erbe e test standard modificati per valutare con precisione l’efficacia e l’idoneità per l’uso tipico del camice da laboratorio.

Abstract

I camici da laboratorio sono ampiamente utilizzati nei laboratori a rischio biologico e nelle strutture sanitarie come indumenti protettivi per prevenire l’esposizione diretta a agenti patogeni, fuoriuscite e ustioni. Questi rivestimenti protettivi a base di cotone forniscono le condizioni ideali per la crescita microbica e i siti di attacco grazie alla loro natura porosa, alla capacità di trattenere l’umidità e alla ritenzione del calore dal corpo dell’utente. Diversi studi hanno dimostrato la sopravvivenza di batteri patogeni su indumenti ospedalieri e camici da laboratorio, agendo come vettori di trasmissione microbica.

Un approccio comune per risolvere questi problemi è l’applicazione di agenti antimicrobici nel finissaggio tessile, ma sono state sollevate preoccupazioni a causa della tossicità e degli effetti ambientali di molte sostanze chimiche sintetiche. La pandemia in corso ha anche aperto una finestra per lo studio di antimicrobici efficaci e formulazioni ecologiche e prive di tossicità. Questo studio utilizza due composti bioattivi naturali, carvacrolo e timolo, incapsulati in nanoparticelle di chitosano, che garantiscono una protezione efficace contro quattro patogeni umani con una riduzione fino a 4 log (99,99%). Questi agenti patogeni sono frequentemente rilevati nei camici da laboratorio utilizzati nei laboratori a rischio biologico.

I tessuti trattati hanno inoltre resistito fino a 10 cicli di lavaggio con riduzione microbica del 90%, sufficiente per l’uso previsto. Abbiamo apportato modifiche ai test standard esistenti sui tessuti per rappresentare meglio gli scenari tipici dell’utilizzo del camice da laboratorio. Questi perfezionamenti consentono una valutazione più accurata dell’efficacia dei camici da laboratorio antimicrobici e la simulazione del destino di eventuali fuoriuscite microbiche accidentali che devono essere neutralizzate in breve tempo. Ulteriori studi sono raccomandati per studiare l’accumulo di agenti patogeni nel tempo sui camici da laboratorio antimicrobici rispetto ai normali camici protettivi.

Introduction

Il camice bianco protettivo è un dispositivo di protezione individuale (DPI) obbligatorio nei laboratori di microbiologia e nelle strutture sanitarie e protegge dall’esposizione diretta a agenti patogeni, fuoriuscite e ustioni. Questi cappotti di cotone promuovono la crescita microbica a causa di molti fattori: il tessuto fornisce siti di attacco e aerazione, cotone e amido utilizzati nel processo di produzione insieme alle cellule epiteliali esfoliate dall’utente forniscono nutrienti e la vicinanza all’utente dà calore e umidità. L’accumulo di microbi sui tessuti può anche causare problemi di salute come allergie e infezioni nosocomiali, odori sgradevoli e deterioramento dei tessuti¹.

A differenza degli indumenti normali, i cappotti protettivi sono raramente lavati o disinfettati, come si trova in molte indagini ^2,3. Molti studi mostrano prove di camici da laboratorio che agiscono come vettore di trasmissione microbica e il rischio di infezioni nosocomiali in ambito sanitario^2,4, ceppi particolarmente resistenti³ come lo Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA); pertanto, sollevano preoccupazioni per la salute dei DPI, che hanno lo scopo di proteggere dalla contaminazione microbica. Non ci sono abbastanza studi trasversali sulle infezioni associate al camice da laboratorio nel contesto delle strutture di biosicurezza di livello 2 (BSL-2) o dei laboratori didattici di microbiologia, ma molte autorità di regolamentazione limitano l’uso di camici da laboratorio all’interno del livello di contenimento. Tuttavia, molte istituzioni accademiche in Nord America lottano per soddisfare i requisiti a causa di vincoli pratici, come il lavaggio e la conservazione all’interno della struttura, gli incidenti di indossare camici da laboratorio in aree pubbliche come mense e biblioteche sono comuni. Una soluzione pratica a questi problemi è l’applicazione di agenti antimicrobici nella finissaggio tessile.

I tessuti antimicrobici stanno guadagnando sempre più popolarità nell’abbigliamento sportivo, nell’abbigliamento sportivo e nelle calze, principalmente destinati a ridurre l’odore del corpo. Tuttavia, l’uso di questi tessuti non è comune nello sviluppo di DPI, ad eccezione di alcune maschere di cotone rivestite d’argento e indumenti sanitari⁵. Riportiamo lo sviluppo di un tessuto antimicrobico per camici da laboratorio, che inibisce i patogeni comuni trovati nei laboratori BSL-2 e rende efficace la protezione dalla contaminazione incrociata di agenti patogeni comuni.

Attualmente sul mercato sono disponibili una varietà di tessuti e finiture antimicrobici, ma la maggior parte di questi utilizza particelle colloidali di metalli pesanti (ad esempio, argento, rame, zinco), organometallici o sostanze chimiche sintetiche come triclosan e composti di ammonio quaternario, che non sono rispettosi dell’ambiente¹ e possono portare a problemi di salute come irritazione cutanea e allergie⁶. Alcune formulazioni sintetiche pongono preoccupazioni a causa di microbi non bersaglio, come la flora normale o l’induzione di resistenza antimicrobica (AMR). La Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti regola i tessuti antimicrobici commerciali, che devono essere non tossici per l’utente e privi di ecotossicità. Pertanto, sono preferibili tessuti antimicrobici a base di biocidi naturali che inibiscono un ampio spettro di microbi. Gli oli essenziali (EO) sono ampiamente utilizzati come agenti antimicrobici e terapeutici, ma il loro uso nella finitura antimicrobica è limitato a causa della loro durata ^6,7,8. Sulla base delle nostre conoscenze e ricerche di mercato sulla finitura nano-erboristica⁸, nessun tessuto antimicrobico a base di erbe è disponibile in commercio. Questo perché i rivestimenti sintetici sono facili da produrre e hanno una lunga durata. Alcuni tessuti rivestiti di nano-erbe segnalati solo per scopi di ricerca includono neem⁷, moringa 9 e foglie di curry⁹.

Il presente studio utilizza due componenti bioattivi estratti dagli OE di origano, carvacrolo e timolo, che sono efficaci contro una vasta gamma di agenti patogeni batterici e virus, ma sono generalmente riconosciuti come sicuri per l’uomo¹⁰. Tuttavia, questi componenti bioattivi sono volatili e quindi il loro potenziale antimicrobico è di breve durata se applicato direttamente al tessuto. L’incapsulamento nano-erboristico è un processo in cui componenti o farmaci bioattivi vengono caricati all’interno di un guscio polimerico che protegge il nucleo dal degrado ambientale e quindi migliora la durata di conservazione. Inoltre, le piccole dimensioni delle particelle polimeriche, che generalmente vanno da 10 nm a 100 nm, migliorano l’efficacia dell’applicazione e rallentano il rilascio dei composti bioattivi sul tessuto. Questi composti bioattivi sono utilizzati per vari scopi, come la conservazione degli alimenti¹⁰, ma non per il rivestimento tessile.

Tra i molti incapsulanti polimerici, il chitosano è un candidato attraente a causa di molti dei suoi attributi, come non tossicità, biodegradabilità, mucoadesività e biocompatibilit๹. È un polisaccaride naturale, ottenuto dal processo di deacetilazione dalla chitina, che si trova nelle conchiglie e nelle pareti cellulari fungine. Viene utilizzato in applicazioni biochimiche e di conservazione degli alimenti come la somministrazione di farmaci o proteine 11,12,13^, il rilascio controllato 14 e le pellicole antimicrobiche ¹⁰. Il chitosano non è facilmente solubile in acqua, ma forma una sospensione colloidale in mezzi acidi. Le molecole bioattive vengono caricate in nanoparticelle di chitosano (NP) con un semplice metodo di gelificazione ionica in due fasi^14,15,16. In questo processo, composti bioattivi idrofobici come il carvacrolo e il timolo formano un’emulsione olio-in-acqua, che è aiutata da un tensioattivo, Tween 80. Successivamente, un composto polianionico, il tripolifosfato pentasodico (TPP), viene utilizzato per formare i legami incrociati tra i gruppi amminici lungo le molecole polimeriche policationiche e i gruppi fosfato delle molecole TPP per stabilizzare il complesso. Questo processo di complessazione solidifica i composti bioattivi all’interno della matrice di chitosano, che viene successivamente purificata e rivestita su campioni di cotone per produrre tessuto antimicrobico.

Le nano-formulazioni devono essere testate prima per l’efficacia antimicrobica in forma di emulsione prima di essere applicate al tessuto. Questo può essere convenientemente valutato con un metodo qualitativo, come la diffusione del disco di Kirby-Bauer, la diffusione del pozzo e il saggio della piastra del cilindro. Tuttavia, il saggio della piastra cilindrica¹⁷ offre la flessibilità di caricare volumi variabili della formulazione e confrontare la zona di gioco. In questo metodo, le formulazioni antimicrobiche vengono caricate in cilindri di acciaio inossidabile e poste su uno strato di agar morbido, che viene inoculato con il microrganismo o l’agente patogeno di prova. Il diametro della zona di clearance prodotta contro l’organismo in esame è proporzionale al potenziale inibitorio della formulazione antimicrobica e pertanto può essere utilizzato come alternativa ai metodi di diluizione del brodo. Tuttavia, la dimensione delle zone chiare è solo una misura comparativa o qualitativa all’interno di una piastra specifica, a meno che non vengano mantenuti standard specifici. Gli agenti antimicrobici agiscono contro i patogeni inibendo la loro crescita (biostatica) o uccidendo le cellule (biocida), che possono essere quantificati rispettivamente dalla concentrazione minima inibitoria (MIC) e dalla concentrazione minima battericida (MBC). Tuttavia, l’efficacia e il comportamento delle sostanze chimiche bioattive sono diversi nelle loro formulazioni (stato liquido) e quando rivestite su un substrato come un tessuto¹⁸. Questo perché molteplici fattori svolgono un ruolo nell’efficacia, come la stabilità dell’aderenza degli agenti antimicrobici al tessuto, il contenuto di umidità, il tipo di substrato e l’aderenza dei microbi. Se lo scopo previsto è solo l’attività batteriostatica, un test qualitativo come il “Parallel Streak Method”¹⁹ può fornire una valutazione relativamente rapida e semplice della formulazione antimicrobica diffusibile. Tuttavia, se si devono determinare gli effetti battericidi, può essere impiegata la “Valutazione delle finiture antibatteriche sui materiali tessili”²⁰ , che fornisce la riduzione logaritmica dell’agente patogeno potenziato.

Protocol

1. Preparazione di nanoparticelle Incapsulamento nano-erboristicoPreparare 50 mL di acido acetico all’1% (v/v).ATTENZIONE: L’acido acetico glaciale è irritante, che può causare gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Indossa un camice da laboratorio a figura intera, guanti in nitrile e occhiali e lavora sotto una cappa aspirante. Preparare la soluzione di chitosano (1,2% p/v) sciogliendo 0,6 g di scaglie di chitosano (peso molecolare medio) in 50 ml di acido acetico a…

Representative Results

Screening iniziale delle NP sintetizzateSeguendo la tecnica dell’emulsione olio-in-acqua in due fasi16, i composti bioattivi (carvacrolo e timolo) sono stati incapsulati con successo nel chitosano. Ciò è stato confermato dalla spettrofotometria UV-Vis per l’assorbimento di picco dei rispettivi composti bioattivi rispetto ai controlli, che erano le NP del chitosano senza composti bioattivi. Le NP costituite sono risultate omogenee e stabili per 12 mesi a 4 °C. Lo screening …

Discussion

L’efficacia antimicrobica dei biocidi è convenzionalmente testata mediante saggi quantitativi, come la concentrazione minima inibitoria (MIC) e la concentrazione battericida minima (MBC), in cui i batteri sono immersi in un liquido antimicrobico per 24 ore. Tuttavia, questi saggi non sono adatti per tessuti spalmati, dove manca l’interfaccia liquida e i biocidi sono diffusi lentamente lungo le fibre del tessuto. Pertanto, sono stati stabiliti molti test standard sui tessuti, come AATCC 147, ISO 20645, AATCC 100 e JIS L …

Materials

Acetic acid	Millipore Sigma	64-19-7
Antibiotic base agar	BD Difco	DF0270-17-4	Also known as Antibiotic Medium 2
Antibiotic seed agar	BD Difco	DF0263-17-3	Also known as Antibiotic Medium 1
Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood)	Donated by CFIA
Bromcresol Purple Lactose Agar	Donated by CFIA
Candida albicans	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 10231
Carvacrol	Millipore Sigma	282197 (CAS# 499-75-2)
Centrifuge  Allergra X-22R Centrifuge	Beckman Coulter	Model # X-22R	Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time.
Chitosan Medium Molecular Weight (CS)	Millipore Sigma	448877 (CAS # 9012-76-4)
Clamshell Heat Press	Intiva	IM1200
Escherichia coli (E. coli)	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 23725
Incubator	Thermo Scientific	1205M34
Letheen Broth	BD Difco	DF0681-17-7	Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product.
Milli Q water	Millipore Sigma	ZR0Q16WW	Deionized water
Mueller-Hinton Agar	BD Difco	DF0252-17-6
Pentasodium tripolyphosphate (TPP)	Millipore Sigma	238503 (CAS# 7758-29-4)
Phospahte Buffered Saline (PBS)	Thermo Scientific	AM9624
Pseudomonas aeruginosa	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 9027
Sabouraud Dextrose Agar	BD Difco	DF0109-17-1
Shaking incubator/ Thermo shaker	VWR	Model# SHKA2000
Staphylococcus aureus	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 6538
Thymol	Millipore Sigma	T0501 (CAS# 89-83-8)
Trypticase Soy Agar	BD Difco	236950
Trypticase Soy Broth	BD Difco	215235
Tween 80	Millipore Sigma	STS0204 (CAS # 9005-65-6)
UV-Vis Spectrophometer	Thermo Scientific	GENESYS 30 (840-277000)