Séquençage ultra-rapide de nouvelle génération basé sur l’amplicon dans le cancer du poumon non épidermoïde non à petites cellules
Summary
L’augmentation du nombre de biomarqueurs moléculaires à tester pour la prise en charge du cancer du poumon non à petites cellules non épidermoïde (NS-NSCLC) a entraîné la mise au point de méthodes de détection moléculaire rapides et fiables. Nous décrivons un flux de travail pour l’évaluation de l’altération génomique chez les patients atteints de NS-CPNPC à l’aide d’une approche de séquençage ultra-rapide de nouvelle génération (NGS).
Abstract
Le nombre d’altérations moléculaires à tester pour le traitement ciblé des patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules non épidermoïde (NS-CPNPC) a considérablement augmenté ces dernières années. La détection d’anomalies moléculaires est obligatoire pour la prise en charge optimale des patients atteints de NS-NSCLC avancés ou métastatiques, ce qui permet d’administrer des thérapies ciblées avec une amélioration de la survie globale. Néanmoins, ces tumeurs développent des mécanismes de résistance qui sont potentiellement ciblables à l’aide de nouvelles thérapies. Certaines altérations moléculaires peuvent également moduler la réponse au traitement. La caractérisation moléculaire du NS-NSCLC doit être réalisée dans un délai d’exécution court (TAT), en moins de 10 jours ouvrables, comme le recommandent les directives internationales. De plus, l’origine des biopsies tissulaires pour l’analyse génomique est diverse, et leur taille ne cesse de diminuer avec le développement de méthodes et de protocoles moins invasifs. Par conséquent, les pathologistes sont mis au défi d’effectuer des techniques moléculaires efficaces tout en maintenant une stratégie de diagnostic efficace et rapide. Nous décrivons ici le flux de travail ultra-rapide de séquençage de nouvelle génération (NGS) basé sur l’amplicon utilisé dans la pratique quotidienne de routine au moment du diagnostic chez les patients atteints de NS-NSCLC. Nous avons montré que ce système est capable d’identifier les cibles moléculaires actuelles utilisées en médecine de précision en oncologie thoracique dans un TAT approprié.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, le développement de thérapies ciblées et d’immunothérapies a considérablement augmenté la survie globale (SG) du cancer du poumon non épidermoïde non à petites cellules (NS-CPNPC)1,2. À cet égard, le nombre de gènes et de cibles moléculaires obligatoires à analyser lors du traitement du CPNPC a augmenté au cours des dernières années 3,4.
Les lignes directrices internationales actuelles recommandent de tester l’EGFR, l’ALK, le ROS1, le BRAF, le NTRK, le RET, le MET et le MET lors du diagnostic du NS-NSCLC5 avancé. De plus, comme de nouveaux médicaments ont récemment donné des résultats très prometteurs dans les essais cliniques, d’autres altérations génomiques seront prochainement criblées dans un certain nombre de gènes supplémentaires, notamment KRAS et HER2, ainsi que BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 et NUT 6,7,8,9. De plus, le statut de différents gènes associés, tels que STK11, KEAP1 et TP53, peut être d’un grand intérêt pour une meilleure prédiction de la réponse ou de la résistance à certaines thérapies ciblées et/ou inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI)10,11,12.
Il est important de noter que les altérations moléculaires doivent être signalées sans délai significatif afin d’assurer une prise de décision clinique prudente. L’absence de caractérisation moléculaire d’une tumeur peut conduire à l’instauration de thérapies non ciblées telles que la chimiothérapie avec/sans immunothérapie, conduisant à une stratégie de traitement sous-optimale, car la réponse à la chimiothérapie est limitée chez les patients présentant des altérations exploitables, telles que des mutations de l’EGFR ou des fusions de gènes13.
De plus, le développement actuel de thérapies/immunothérapies ciblées dans des contextes néoadjuvants et/ou adjuvants pourrait conduire à rechercher systématiquement, au moins, des altérations de l’EGFR et de l’ALK dans le NS-NSCLC à un stade précoce, car les ICI ne devraient être administrées que dans les tumeurs de type sauvage pour l’EGFR et l’ALK14. Il est désormais également obligatoire de tester la présence de mutations de l’EGFR dans le NS-NSCLC à un stade précoce, car l’osimertinib (un inhibiteur de la tyrosine kinase de l’EGFR de troisième génération) peut être utilisé comme traitement adjuvant dans le NS-NSCLC15 mutant de l’EGFR.
La stratégie d’évaluation des différents biomarqueurs pour prédire la réponse à différentes thérapies ciblées et/ou immunothérapies chez les patients atteints de NS-CPNPC évolue rapidement, ce qui rend l’identification de ces biomarqueurs séquentiellement difficile 3,16. À cet égard, le séquençage de nouvelle génération (NGS) est maintenant l’approche optimale pour l’évaluation parallèle à haut débit des altérations génétiques dans le NS-NSCLC 5,17.
Cependant, le flux de travail NGS peut être difficile à maîtriser et peut conduire à un TAT18,19 plus long. Ainsi, de nombreux centres pratiquent encore des approches séquentielles (immunohistochimie (IHC), hybridation in situ par fluorescence (FISH) et/ou séquençage ciblé). Cependant, cette stratégie est limitée dans le cas d’un échantillon de petite taille et, surtout, en raison de l’augmentation du nombre de mutations exploitables qui doivent être testées dans le NS-CPNPC20. Ainsi, les méthodes de test ultra-rapides et simples permettant l’évaluation rapide des altérations génétiques sont devenues de plus en plus importantes pour une prise de décision clinique optimale. De plus, les systèmes approuvés et accrédités pour les tests moléculaires deviennent obligatoires pour la prescription de thérapies ciblées spécifiques.
Nous décrivons ici un test NGS ADN/ARN ultra-rapide et automatisé à base d’amplicon pour les tests moléculaires du NS-NSCLC qui est utilisé dans le Laboratoire de Pathologie Clinique et Expérimentale (LPCE) du CHU de Nice, France et qui est accrédité selon la norme ISO 15189 par le Comité Français d’Accréditation (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). Le COFRAC certifie que le laboratoire répond aux exigences de la norme ISO 15189 et des règles d’application COFRAC pour les activités d’essais/étalonnage en analyse moléculaire en NGS automatisé sur séquenceur avec le panel réalisé par le laboratoire. L’accréditation selon la norme internationale reconnue ISO 15189 atteste de la compétence technique du laboratoire pour un périmètre défini et du bon fonctionnement d’un système de management approprié dans ce laboratoire. Les avantages et les limites de ce flux de travail, depuis la préparation des échantillons de biopsie tissulaire jusqu’à l’obtention du rapport, sont discutés.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mise au point d’une approche NGS ultra-rapide basée sur l’amplicon en tant que test réflexe pour l’évaluation de l’altération moléculaire au diagnostic de n’importe quel stade du NS-NSLC est une option optimale pour la détection de tous les biomarqueurs recommandés et émergents recommandés par les lignes directrices dans NS-NSCLC 5,22,23. Alors que les méthodes séquentielles (IHC, PCR, FISH) se concentren…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Thermo Fisher Scientific de nous avoir donné la possibilité d’utiliser leur appareil et leurs matériaux.
Materials
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
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