Сверхбыстрое секвенирование нового поколения на основе ампликонов при неплоскоклеточном немелкоклеточном раке легкого
Summary
Увеличение количества молекулярных биомаркеров, подлежащих тестированию для лечения неплоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого (NS-NSCLC), привело к разработке быстрых и надежных методов молекулярного обнаружения. Мы описываем рабочий процесс для оценки геномных изменений у пациентов с НС-НМРЛ с использованием подхода сверхбыстрого секвенирования нового поколения (NGS).
Abstract
За последние несколько лет значительно возросло количество молекулярных изменений, которые необходимо исследовать для таргетной терапии пациентов с неплоскоклеточным немелкоклеточным раком легкого (НС-НМРЛ). Выявление молекулярных аномалий является обязательным для оптимального лечения пациентов с распространенным или метастатическим НМРЛ, что позволяет назначать таргетную терапию с улучшением общей выживаемости. Тем не менее, эти опухоли развивают механизмы резистентности, на которые потенциально можно воздействовать с помощью новых методов лечения. Некоторые молекулярные изменения также могут модулировать реакцию на лечение. Молекулярная характеристика NS-NSCLC должна быть выполнена в сжатые сроки (ТАТ), менее чем за 10 рабочих дней, как рекомендовано международными рекомендациями. Кроме того, происхождение биопсий тканей для геномного анализа разнообразно, и их размер постоянно уменьшается с развитием менее инвазивных методов и протоколов. Следовательно, перед патологоанатомами встает задача применения эффективных молекулярных методов, сохраняя при этом эффективную и быструю стратегию диагностики. В этой статье мы опишем сверхбыстрый рабочий процесс секвенирования нового поколения (NGS) на основе ампликонов, используемый в повседневной практике при диагностике пациентов с НС-НМРЛ. Мы показали, что эта система способна идентифицировать современные молекулярные мишени, используемые в прецизионной медицине в торакальной онкологии, в соответствующем ТАТ.
Introduction
За последнее десятилетие развитие таргетной и иммунотерапии значительно повысило общую выживаемость (ОВ) при неплоскоклеточном немелкоклеточном раке легкого (НС-НМРЛ)1,2. В связи с этим количество обязательных генов и молекулярных мишеней для анализа при лечении НС-НМРЛ увеличилось за последние несколько летна 3,4.
Современные международные рекомендации рекомендуют тестировать EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET и MET при диагностике распространенного NS-NSCLC5. Более того, поскольку новые препараты в последнее время дали очень многообещающие результаты в клинических испытаниях, дополнительные геномные изменения в ближайшее время будут проверены в ряде дополнительных генов, в частности, KRAS и HER2, а также BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 и NUT 6,7,8,9. Кроме того, состояние различных ассоциированных генов, таких как STK11, KEAP1 и TP53, может представлять большой интерес для лучшего прогнозирования ответа или резистентности к некоторым таргетным методам лечения и/или ингибиторам контрольных точек иммунного ответа (ICI)10,11,12.
Важно отметить, что о молекулярных изменениях необходимо сообщать без существенной задержки, чтобы обеспечить тщательное принятие клинических решений. Отсутствие молекулярной характеристики опухоли может привести к началу нетаргетной терапии, такой как химиотерапия с иммунотерапией или без нее, что приводит к неоптимальной стратегии лечения, поскольку ответ на химиотерапию ограничен у пациентов с действенными изменениями, такими как мутации EGFR или слияние генов13.
Более того, нынешнее развитие таргетной терапии/иммунотерапии в неоадъювантных и/или адъювантных условиях может привести к систематическому поиску, по крайней мере, изменений EGFR и ALK на ранних стадиях NS-NSMРL, поскольку ИКТ следует назначать только при опухолях дикого типа для EGFR и ALK14. В настоящее время также является обязательным тестирование на наличие мутаций EGFR на ранних стадиях NS-NSCLC, поскольку осимертиниб (ингибитор тирозинкиназы EGFR третьего поколения) может быть использован в качестве адъювантной терапии при EGFR-мутантном NS-NSCLC15.
Стратегия оценки различных биомаркеров при прогнозировании ответа на различные таргетные терапии и/или иммунотерапию у пациентов с НС-НМРЛ развивается быстрыми темпами, что затрудняет последовательную идентификацию этих биомаркеров 3,16. В связи с этим секвенирование нового поколения (NGS) в настоящее время является оптимальным подходом для высокопроизводительной параллельной оценки изменений генов в NS-NSCLC 5,17.
Тем не менее, рабочий процесс NGS может быть сложным в освоении и может привести к более длительному ТАТ18,19. Таким образом, во многих центрах до сих пор применяются последовательные подходы (иммуногистохимия (ИГХ), флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и/или таргетное секвенирование). Тем не менее, эта стратегия ограничена в случае небольшого размера выборки и, прежде всего, из-за увеличения числа действенных мутаций, которые необходимо протестировать в NS-NSCLC20. Таким образом, сверхбыстрые и простые методы тестирования, позволяющие быстро оценить изменения генов, становятся все более важными для принятия оптимальных клинических решений. Кроме того, одобренные и аккредитованные системы молекулярного тестирования становятся обязательными для назначения специфической таргетной терапии.
В данной статье мы опишем сверхбыстрый и автоматизированный анализ ДНК/РНК NGS на основе ампликонов для молекулярного тестирования NS-NSCLC, который используется в Лаборатории клинической и экспериментальной патологии (LPCE) Университетской больницы Ниццы, Франция и аккредитован в соответствии с нормой ISO 15189 Французским комитетом по аккредитации (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). COFRAC удостоверяет, что лаборатория выполняет требования стандарта ISO 15189 и правил применения COFRAC для деятельности по испытаниям/калибровке при молекулярном анализе в автоматизированном NGS на секвенаторе с панелью, выполняемой лабораторией. Аккредитация в соответствии с признанным международным стандартом ISO 15189 демонстрирует техническую компетентность лаборатории в определенной области и надлежащее функционирование соответствующей системы менеджмента в этой лаборатории. Обсуждаются преимущества и ограничения этого рабочего процесса, начиная с подготовки образцов для биопсии тканей и заканчивая получением отчета.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разработка подхода NGS на основе сверхбыстрого ампликона в качестве рефлекторного тестирования для оценки молекулярных изменений при диагностике любой стадии NS-NSLC является оптимальным вариантом для выявления всех рекомендованных и новых биомаркеров в NS-NSCLC <sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим компанию Thermo Fisher Scientific за предоставленную нам возможность использовать их оборудование и материалы.
Materials
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
References
- Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
- Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
- Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
- Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
- Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
- Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
- Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
- Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
- Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
- Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
- Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
- Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
- Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O’Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
- Wu, Y. -. L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
- de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
- DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
- Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
- Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
- Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
- Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
- Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
- Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
- Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
- Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
- Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
- Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
- Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
- Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
- Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
- Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
- Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
- Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
- Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
- Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
- Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
- Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
- Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
- Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).
