Ultraschnelle Amplicon-basierte Next-Generation-Sequenzierung bei nicht-plattenepithelialem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs
Summary
Die Zunahme molekularer Biomarker, die für die Behandlung von nicht-plattenepithelialem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NS-NSCLC) getestet werden sollen, hat zur Entwicklung schneller und zuverlässiger molekularer Nachweismethoden geführt. Wir beschreiben einen Arbeitsablauf für die Beurteilung genomischer Veränderungen bei NS-NSCLC-Patienten unter Verwendung eines ultraschnellen Next Generation Sequencing (NGS)-Ansatzes.
Abstract
Die Zahl der molekularen Veränderungen, die für die zielgerichtete Therapie von Patienten mit nicht-plattenepithelialem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NS-NSCLC) getestet werden sollen, hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Der Nachweis molekularer Anomalien ist für die optimale Versorgung von Patienten mit fortgeschrittenem oder metastasiertem NS-NSCLC unerlässlich, so dass zielgerichtete Therapien mit einer Verbesserung des Gesamtüberlebens verabreicht werden können. Nichtsdestotrotz entwickeln diese Tumoren Resistenzmechanismen, die mit neuartigen Therapien potenziell angegriffen werden können. Einige molekulare Veränderungen können auch das Ansprechen auf die Behandlung modulieren. Die molekulare Charakterisierung von NS-NSCLC muss in einer kurzen Durchlaufzeit (TAT) von weniger als 10 Arbeitstagen durchgeführt werden, wie es in den internationalen Leitlinien empfohlen wird. Darüber hinaus ist die Herkunft der Gewebebiopsien für die Genomanalyse vielfältig, und ihre Größe nimmt mit der Entwicklung weniger invasiver Methoden und Protokolle kontinuierlich ab. Folglich stehen Pathologen vor der Herausforderung, effektive molekulare Techniken anzuwenden und gleichzeitig eine effiziente und schnelle Diagnosestrategie aufrechtzuerhalten. Hier beschreiben wir den ultraschnellen Amplicon-basierten Next-Generation-Sequencing-Workflow (NGS), der in der täglichen Routinepraxis bei der Diagnose von NS-NSCLC-Patienten verwendet wird. Wir konnten zeigen, dass dieses System in der Lage ist, die aktuellen molekularen Targets, die in der Präzisionsmedizin in der thorakalen Onkologie verwendet werden, in einem geeigneten TAT zu identifizieren.
Introduction
In den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung zielgerichteter Immuntherapien das Gesamtüberleben (OS) von nicht-plattenepithelialem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NS-NSCLC) signifikant erhöht1,2. In diesem Zusammenhang hat die Anzahl der obligatorischen Gene und molekularen Ziele, die bei der Behandlung von NS-NSCLC analysiert werden müssen, in den letzten Jahren zugenommen 3,4.
Aktuelle internationale Leitlinien empfehlen die Untersuchung von EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET, und MET bei der Diagnose von fortgeschrittenem NS-NSCLC5. Da neue Medikamente in jüngster Zeit in klinischen Studien sehr vielversprechende Ergebnisse erzielt haben, werden in Kürze weitere genomische Veränderungen in einer Reihe weiterer Gene untersucht, insbesondere KRAS und HER2 sowie BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 und NUT 6,7,8,9. Darüber hinaus kann der Status verschiedener assoziierter Gene wie STK11, KEAP1 und TP53 von großem Interesse sein, um das Ansprechen oder die Resistenz auf bestimmte zielgerichtete Therapien und/oder Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) besser vorhersagen zu können10,11,12.
Wichtig ist, dass die molekularen Veränderungen ohne signifikante Verzögerung gemeldet werden müssen, um eine sorgfältige klinische Entscheidungsfindung zu gewährleisten. Das Fehlen einer molekularen Charakterisierung eines Tumors kann zur Einleitung nicht-zielgerichteter Therapien wie Chemotherapie mit/ohne Immuntherapie führen, was zu einer suboptimalen Behandlungsstrategie führt, da das Ansprechen auf die Chemotherapie bei Patienten mit verwertbaren Veränderungen wie EGFR-Mutationen oder Genfusionen begrenzt ist13.
Darüber hinaus könnte die derzeitige Entwicklung zielgerichteter Therapien/Immuntherapien in neoadjuvanten und/oder adjuvanten Settings dazu führen, dass systematisch zumindest nach EGFR– und ALK-Veränderungen bei NS-NSCLC im Frühstadium gesucht wird, da ICIs nur bei Tumoren verabreicht werden sollten, die Wildtyp-Tumoren für EGFR und ALK14 sind. Es ist nun auch obligatorisch, auf das Vorhandensein von EGFR-Mutationen bei NS-NSCLC im Frühstadium zu testen, da Osimertinib (ein EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitor der dritten Generation) als adjuvante Therapie bei EGFR-mutiertem NS-NSCLC eingesetzt werden kann15.
Die Strategie zur Bewertung der verschiedenen Biomarker zur Vorhersage des Ansprechens auf verschiedene zielgerichtete Therapien und/oder Immuntherapien bei NS-NSCLC-Patienten schreitet schnell voran, was die Identifizierung dieser Biomarker sequentiell schwierig macht 3,16. In dieser Hinsicht ist Next-Generation Sequencing (NGS) nun der optimale Ansatz für die parallele Hochdurchsatz-Bewertung von Genveränderungen bei NS-NSCLC 5,17.
Der NGS-Workflow kann jedoch schwierig zu meistern sein und zu längeren TAT18,19 führen. Daher führen viele Zentren immer noch sequentielle Ansätze durch (Immunhistochemie (IHC), Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und/oder gezielte Sequenzierung). Diese Strategie ist jedoch bei geringer Stichprobengröße und vor allem wegen der erhöhten Anzahl von verwertbaren Mutationen, die in NS-NSCLC20 getestet werden müssen, begrenzt. Ultraschnelle und unkomplizierte Testmethoden, die eine schnelle Beurteilung von Genveränderungen ermöglichen, werden daher für eine optimale klinische Entscheidungsfindung immer wichtiger. Darüber hinaus werden zugelassene und akkreditierte Systeme für molekulare Tests für die Verschreibung spezifischer zielgerichteter Therapien verpflichtend.
Hier beschreiben wir einen ultraschnellen und automatisierten Amplicon-basierten DNA/RNA NGS-Assay für die molekulare Testung von NS-NSCLC, der im Labor für klinische und experimentelle Pathologie (LPCE) des Universitätsklinikums Nizza, Frankreich, verwendet wird und nach der Norm ISO 15189 vom französischen Akkreditierungsausschuss (COFRAC) akkreditiert ist (https://www.cofrac.fr/). Die COFRAC bescheinigt, dass das Labor die Anforderungen der Norm ISO 15189 und der COFRAC-Anwendungsregeln für die Tätigkeiten der Prüfung/Kalibrierung in der molekularen Analyse in automatisierter NGS auf einem Sequenzierer mit dem vom Labor durchgeführten Panel erfüllt. Die Akkreditierung nach der anerkannten internationalen Norm ISO 15189 belegt die technische Kompetenz des Labors für einen definierten Umfang und den ordnungsgemäßen Betrieb eines geeigneten Managementsystems in diesem Labor. Die Vorteile und Grenzen dieses Arbeitsablaufs, beginnend mit der Vorbereitung der Gewebebiopsieproben bis hin zur Erstellung des Berichts, werden diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung eines ultraschnellen Amplicon-basierten NGS-Ansatzes als Reflextest zur Beurteilung molekularer Veränderungen bei der Diagnose eines NS-NSLC in jedem Stadium ist eine optimale Option für den Nachweis aller leitlinienempfohlenen und neu auftretenden Biomarker bei NS-NSCLC 5,22,23. Während sich sequentielle Methoden (IHC, PCR, FISH) nur auf bestimmte Gene konzentrieren und zu einer Erschöpfung des Gewebemateria…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Thermo Fisher Scientific für die Möglichkeit, ihr Gerät und ihre Materialien zu verwenden.
Materials
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
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