비편평 비소세포폐암의 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석
Summary
비편평 비소세포폐암(NS-NSCLC) 치료 관리를 위해 검사해야 하는 분자 바이오마커가 증가함에 따라 빠르고 신뢰할 수 있는 분자 검출 방법의 개발이 촉진되었습니다. 초고속 차세대 염기서열분석(NGS) 접근법을 사용하여 NS-NSCLC 환자에 대한 게놈 변형 평가를 위한 워크플로우를 설명합니다.
Abstract
비편평 비소세포폐암(NS-NSCLC) 환자의 표적 치료를 위해 검사해야 하는 분자 변형의 수는 지난 몇 년 동안 크게 증가했습니다. 진행성 또는 전이성 NS-NSCLC 환자의 최적 치료를 위해서는 분자 이상 검출이 필수적이며, 이를 통해 표적 치료제를 투여하여 전체 생존율을 개선할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 종양은 새로운 치료법을 사용하여 잠재적으로 표적화할 수 있는 내성 기전을 발달시킵니다. 일부 분자 변화는 치료 반응을 조절할 수도 있습니다. NS-NSCLC의 분자 특성 분석은 국제 지침에서 권장하는 대로 영업일 기준 10일 이내에 짧은 처리 시간(TAT) 내에 수행되어야 합니다. 또한 게놈 분석을 위한 조직 생검의 기원은 다양하며 덜 침습적인 방법 및 프로토콜의 개발로 크기가 지속적으로 감소하고 있습니다. 결과적으로, 병리학자들은 효율적이고 신속한 진단 전략을 유지하면서 효과적인 분자 기술을 수행해야 하는 과제에 직면해 있습니다. 여기에서는 NS-NSCLC 환자의 진단 시 일상 진료에 사용되는 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석(NGS) 워크플로우에 대해 설명합니다. 우리는 이 시스템이 적절한 TAT에서 흉부 종양학의 정밀 의학에 사용되는 현재 분자 표적을 식별할 수 있음을 보여주었습니다.
Introduction
지난 10년 동안 표적 및 면역 치료제의 개발로 비편평 비소세포폐암(NS-NSCLC)의 전체 생존율(OS)이 크게 증가했습니다1,2. 이와 관련하여, NS-NSCLC를 치료할 때 분석해야 하는 필수 유전자 및 분자 표적의 수는 지난 몇 년 동안 증가했습니다 3,4.
현재 국제 가이드라인은 진행성 NS-NSCLC 5 진단 시 EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET 및 MET를 검사할 것을 권장하고있다. 더욱이 최근 신약이 임상시험에서 매우 유망한 결과를 내놓으면서 BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 및 NUT 6,7,8,9와 함께 KRAS 및 HER2와 같은 여러 추가 유전자에서 추가 게놈 변형이 곧 스크리닝될 것입니다. 또한 STK11, KEAP1 및 TP53과 같은 다양한 관련 유전자의 상태는 일부 표적 치료제 및/또는 면역관문억제제(ICI)10,11,12에 대한 반응 또는 내성을 더 잘 예측하는 데 큰 도움이 될 수 있습니다.
중요한 것은 신중한 임상 의사 결정을 보장하기 위해 분자 변화를 큰 지체 없이 보고해야 한다는 것입니다. 종양의 분자 특성 분석이 없으면 EGFR 돌연변이 또는 유전자 융합과 같은 실행 가능한 변화가 있는 환자에서 화학요법 반응이 제한되기 때문에 면역요법 유무에 관계없이 화학요법과 같은 비표적 요법의 시작으로 이어질 수 있으며, 이는 차선의 치료 전략으로 이어질 수 있다13.
더욱이, 신보조요법 및/또는 보조요법 환경에서 표적치료제/면역요법의 현재 개발은 ICI가 EGFR 및 ALK14에 대해 야생형 종양에만 투여되어야 하기 때문에 초기 단계의 NS-NSCLC에서 적어도 EGFR 및 ALK 변형을 체계적으로 찾을 수 있습니다. EGFR 돌연변이 NS-NSCLC15에서 오시머티닙(osimertinib, 3세대 EGFR 티로신 키나아제 억제제)을 보조요법으로 사용할 수 있기 때문에 초기 단계의 NS-NSCLC에서 EGFR 돌연변이의 존재 여부를 검사하는 것도 필수입니다.
NS-NSCLC 환자에서 다양한 표적 치료제 및/또는 면역 요법에 대한 반응을 예측할 때 다양한 바이오마커를 평가하는 전략은 빠르게 진행되고 있으며, 이로 인해 이러한 바이오마커를 순차적으로 식별하기가 어렵습니다 3,16. 이와 관련하여 차세대 염기서열분석(NGS)은 이제 NS-NSCLC 5,17에서 유전자 변형에 대한 고처리량 병렬 평가를 위한 최적의 접근 방식입니다.
그러나 NGS 워크플로우는 마스터하기 어려울 수 있으며 더 긴 TAT18,19까지 수행될 수 있습니다. 따라서 많은 센터가 여전히 순차적 접근법(면역조직화학(IHC), 형광 in situ hybridization(FISH) 및/또는 표적 염기서열분석)을 수행합니다. 그러나 이 전략은 샘플 크기가 작은 경우, 그리고 무엇보다도 NS-NSCLC20에서 테스트해야 하는 실행 가능한 돌연변이의 수가 증가하기 때문에 제한적입니다. 따라서 유전자 변형을 신속하게 평가할 수 있는 초고속의 간단한 검사 방법은 최적의 임상 의사 결정을 위해 점점 더 중요해지고 있습니다. 더욱이, 분자 검사를 위한 승인 및 공인된 시스템은 특정 표적 치료제의 처방을 위해 의무화되고 있습니다.
여기에서는 프랑스 니스 대학병원의 임상 및 실험 병리학 실험실(LPCE)에서 사용되고 프랑스 인증 위원회(COFRAC)(https://www.cofrac.fr/)의 ISO 15189 표준에 따라 인증된 NS-NSCLC의 분자 검사를 위한 초고속 자동 앰플리콘 기반 DNA/RNA NGS 분석에 대해 설명합니다. COFRAC는 실험실이 실험실에서 수행한 패널을 사용하여 시퀀서의 자동화된 NGS에서 분자 분석의 테스트/보정 활동에 대한 표준 ISO 15189 및 COFRAC 적용 규칙의 요구 사항을 충족함을 인증합니다. 공인된 국제 표준 ISO 15189에 따른 인증은 정의된 범위에 대한 실험실의 기술적 역량과 이 실험실에서 적절한 관리 시스템의 적절한 작동을 입증합니다. 조직 생검 샘플 준비부터 보고서 획득에 이르기까지 이 워크플로우의 이점과 한계에 대해 논의합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모든 단계의 진단 시 분자 변화 평가를 위한 반사 검사로서 초고속 앰플리콘 기반 NGS 접근법의 개발은 NS-NSCLC 5,22,23에서 지침에서 권장하는 모든 바이오마커 및 새로운 바이오마커를 검출하기 위한 최적의 옵션입니다. 순차적 방법(IHC, PCR, FISH)은 특정 유전자에만 초점을 맞추고 조직 물질 고갈을 초래할 수 있지만, 이 NGS 워크?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thermo Fisher Scientific의 장치와 재료를 사용할 수 있는 기회를 제공해 주셔서 감사합니다.
Materials
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
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