Detta manuskript beskriver en ny direkt växtinfusionsanordning för screening av molekylernas effektivitet mot bakterierna (Candidatus Liberibacter asiaticus) eller dess insektsvektor (Diaphorina citri, Kuwayama) som i kombination är associerade med Huanglongbing citrussjukdom.
Att testa funktionen av terapeutiska föreningar i växter är en viktig del av jordbruksforskningen. Blad- och jorddränkningsmetoder är rutinmässiga men har nackdelar, inklusive varierande upptag och miljönedbrytning av testade molekyler. Staminjektion av träd är väletablerad, men de flesta metoder för detta kräver dyr, proprietär utrustning. För att screena olika behandlingar för Huanglongbing behövs en enkel, billig metod för att leverera dessa föreningar till kärlvävnaden hos små växthusodlade citrusträd infekterade med den floembegränsade bakterien Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) eller infekterad med den floemmatande CLas-insektsvektorn Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
För att uppfylla dessa screeningkrav utformades en direkt växtinfusionsanordning (DPI) som ansluts till anläggningens stam. Enheten är tillverkad med ett nylonbaserat 3D-utskriftssystem och lätt åtkomliga hjälpkomponenter. Föreningens upptagseffekt av denna anordning testades i citrusväxter med användning av fluorescerande markören 5,6-karboxifluoresceindiacetat. Enhetlig sammansatt fördelning av markören genom växterna observerades rutinmässigt.
Vidare användes denna anordning för att leverera antimikrobiella och insekticida molekyler för att bestämma deras effekter på CLas respektive D. citri. Aminoglykosidantibiotikumet streptomycin levererades till CLas-infekterade citrusväxter med hjälp av enheten, vilket resulterade i en minskning av CLas-titern från 2 veckor till 4 veckor efter behandlingen. Att leverera neonicotinoidinsekticiden imidakloprid till D. citri-infekterade citrusväxter resulterade i en signifikant ökning av psylliddödligheten efter 7 dagar. Dessa resultat tyder på att denna DPI-enhet representerar ett användbart system för att leverera molekyler till växter för testning och underlätta forskning och screening.
Förvaltningen av växter i kommersiella och landskapsinställningar kräver ofta användning av kemiska föreningar för att optimera växttillväxt och hälsa. Hur dessa molekyler levereras beror på typen av molekyl, molekylens funktion, typen av växt och hanteringssystemet på plats. Blad- och jordapplikationer är de enklaste leveransstrategierna, men begränsningar i upptaget av vissa molekyler kräver direkt leverans. Ett exempel på dessa molekyler är terapeutiska molekyler som fungerar bäst när de rör sig systemiskt inom växten men inte kan levereras effektivt genom enkla topiska applikationer1. Detta är fallet med Huanglongbing (HLB), även kallad citrusgrönande sjukdom. HLB är en sjukdom associerad med en floembegränsad bakterie, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), som inte kan odlas utanför växten, eller dess insektsvektor, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Om de förmodade terapeutiska molekylerna är genprodukter kan de testas genom att skapa transgena växter som uttrycker dessa föreningar. Transgen växtproduktion kan dock vara tids- och resurskrävande, är mycket genotypberoende och kan hämmas av gendämpning3. Dessutom, även om dessa transgener visar lovande resultat, minskar regleringsmässiga och offentliga uppfattningsbegränsningar sannolikheten för deras kommersiella acceptans 4,5. Den exogena appliceringen av föreningar förenklar emellertid testningen av biologiska och syntetiska molekyler eftersom det inte kräver produktion av stabila eller tillfälligt uttryckande transgena växter, vilket minskar tiden och resurserna för att testa en molekyls effekter. En metod för effektiv och ändamålsenlig systemisk växttillförsel av exogena föreningar skulle kunna användas för en mängd olika forsknings- och screeningändamål.
En av dessa tillämpningar är analys av systemisk molekylrörelse inom en växts kärlsystem, vilket kan göras med hjälp av spårbara markörer, oavsett om de är fluorescerande, synliga eller unika kemiska isotoper 6,7,8,9. En vanlig fluorescerande markör är 5,6-karboxifluorescein-diacetat (CFDA), som är ett membrangenomsläppligt färgämne som bryts ned av intracellulära esteraser till 5,6-karboxifluorescein (CF) och därefter blir fluorescerande och membranogenomträngligt10. CFDA har använts i stor utsträckning för att övervaka floemtransport, sänk- och källrelationer och vaskulaturmönster i växtvävnad11,12.
Förutom dessa markörer kan vissa föreningar direkt förändra växtens fysiologi för att öka produktiviteten eller döda växten när det gäller herbicider. Både insekticider och antimikrobiella föreningar är ett sätt att öka växtproduktiviteten, särskilt i närvaro av HLB. Ett exempel på en antimikrobiell molekyl som används för att kontrollera CLas är streptomycin. Streptomycin är ett aminoglykosidantibiotikum som ursprungligen isolerades från Streptomyces griseus och har visat sig hämma bakterietillväxt genom hämning av proteinbiosyntes13. När det gäller insekticider är huvudmålet för HLB-forskning D. citri, som överför CLas från trädtill träd 14. För detta ändamål används neonicotinoider, såsom imidakloprid, vanligtvis, eftersom de är guldstandarden för bekämpning av skadedjur15. Alla dessa olika användningsområden är viktiga aspekter av nuvarande strategier för växtförvaltning, och utvecklingen av nya produkter är beroende av effektiva screeninganalyser.
En metod som används för införande av föreningar i träiga växter är direkt injektion i stammen. En mängd olika system har utformats som varierar i deras behov av förborrade injektionsställen, och dessa system använder antingen tryckbaserad injektion eller passivt flöde16. Även om tryckbaserade system möjliggör snabb introduktion av en given förening, måste den potentiella fysiska skada som orsakas av att tvinga vätska genom blockerad eller emboliserad vaskulatur beaktas17. Även om applicering av föreningar på blad eller dränk är mindre tidskrävande att genomföra, minskar direkt växtinjektion avfall av föreningen av intresse på grund av förluster i luften eller jorden och kan också förlänga den tid som föreningarna är i ett aktivt tillstånd genom att minska exponeringen för den yttre miljön18. Båda dessa aspekter är viktiga för att bevara dyra reagens och säkerställa konsistens mellan replikat i forskningsinställningar.
Denna studie beskriver design, konstruktion och användning av en innovativ direkt växtinfusionsanordning (DPI), som kan användas för att bedöma hur föreningar av intresse påverkar en värdväxt. En standard 3D-skrivare användes för att tillverka både själva enheten och flera komponenter i samband med dess konstruktion. Denna interna konstruktionsmetod gör det möjligt för forskare att modifiera enheten och enhetskomponenterna baserat på deras specifika experimentella behov och minskar beroendet av kommersiellt tillgängliga växtinjektionsanordningar. Enhetsinstallationen är enkel och effektiv, och alla hjälpkomponenter är lättillgängliga och billiga. Även om systemet utformades för användning med en mängd olika växtarter, avser exemplen som presenteras här krukväxter citrusväxter. Dessutom visar denna studie att denna enhet effektivt kan leverera flera typer av föreningar systemiskt till unga citrusväxter utan att orsaka dödlighet. De testade föreningarna inkluderade CFDA, som användes för att bedöma föreningsfördelningen i växten, och streptomycin och imidakloprid, som användes för att verifiera att de antimikrobiella och insekticida effekterna av dessa föreningar observerades när de levererades via DPI.
För att DPI-produkten ska anses vara en livskraftig metod för tillförsel av exogena föreningar till växter måste den bidra till ett robust och konsekvent upptag av föreningar i en mängd olika vävnadstyper. Experimentet med CFDA visade tydligt både akropetal och basipetal föreningsrörelse, liksom i både kärlsystemet och mesofyllcellerna i bladet. Dessutom, och förmodligen eftersom det borrade hålet som används i denna DPI-enhet ger en stor mängd yta för sammansatt upptag, var CFDA närvarande i relativt lika stora mängder i alla delar av stammen, inte bara i en liten delmängd av vaskulaturen intill enheten, vilket har setts i tidigare färgupptagningsstudier i växter som använder staminjektion6. Dessutom testades leveransen av grönt fluorescerande protein och blommigt färgämne med användning av DPI-enheten, och en fördelning av dessa föreningar som liknar CFDA observerades (data visas inte). Dessa data tyder på att enheten kan användas för att systemiskt leverera en mängd olika föreningar som varierar i storlek och molekylstruktur. Det är dock värt att notera att det fanns skillnader i föreningens upptag baserat på bladutvecklingsstadiet, med yngre utvecklande löv som tog upp mer förening än äldre etablerade löv. Detta kan bero på förändringarna i vaskulaturegenskaperna som finns i diskbänken kontra källvävnad och bör optimeras för ett givet experiment.
DPI-enheten visade tillräckligt sammansatt upptag för visualisering av CFDA, GFP och blommigt färgämne, och det tog också tillräckligt för att visa de antibakteriella och insekticida effekterna av streptomycin respektive imidakloprid. Båda dessa föreningar resulterade i förändringar i målorganismens livskraft 1 vecka efter en enda 2,0 ml behandling. Dessa data tyder på att DPI-enheten skulle kunna användas i helväxtanalyser för att testa livskraften hos en mängd olika föreningar för bekämpning av mikrobiella och skadliga skadedjur. Dessutom, på grund av dess direkta kontakt med kärlsystemet, kan denna anordning till och med ge möjlighet att testa föreningar som inte effektivt tas upp av rötterna eller epidermala celler. Av särskilt intresse skulle vara RNA-interferens (RNAi), eftersom detta kan användas för att modulera genuttrycket inom värdväxten, patogenen eller patogenvektorn. Tidigare forskning som introducerade hårnåls-RNA genom ett borrat hål i stammen på äppel- och druvplantor visade att RNA-molekylerna var begränsade till xylemvävnaden, vilket tyder på att dessa molekyler endast kan vara effektiva mot tugg- och xylemsaftmatande organismer22. Med tanke på att DPI-enheten använder ett liknande borrhålsleveranssystem, är det självklart att hårnåls-RNA som levereras med denna enhet också kan begränsas till xylemvävnaden. Den observerade minskningen av titern av den floembegränsade CLas efter streptomycinbehandling från DPI-enheten tyder emellertid starkt på att detta antibiotikum var närvarande i floemet. Därför är det troligt att den vaskulära fördelningen av de föreningar som levereras med användning av DPI-enheten är beroende av deras storlek och kemi, och varje molekyl bör utvärderas individuellt.
Även om det finns ett antal kommersiellt tillgängliga DPI-enheter tillgängliga på marknaden, kan enheten som beskrivs här tillverkas internt och kan modifieras. På detta sätt kan förbättringar och storleksförändringar göras baserat på växtarter och experimentell design som används, och det är inte beroende av kommersiella produkter. Dessutom är anordningen semi-permanent fäst vid växten, vilket innebär att flera behandlingar av en given förening kan utföras samtidigt utan att behöva skada växten med flera sammansatta injektioner. På en försiktighetsanmärkning kan enheten läcka om den inte är korrekt installerad. Som ett resultat går föreningen förlorad för miljön istället för att levereras till anläggningen. Därför bör man vara noga med att inspektera enheten för tecken på läckage under installationen och de första dagarna efteråt. Även om borrning av ett hål i trädet är potentiellt skadligt, valdes denna metod för att säkerställa robust och konsekvent sammansatt upptag. Dessutom sågs inga negativa effekter på växthälsan från fastsättningen av DPI-enheten i dessa experiment. Extra växter bör dock inkluderas i experimentdesignen för att ersätta de som kan förlora kraft under ett givet experiment. Slutligen, eftersom denna anordning använder passivt flöde för att införa föreningar, kan det vara svårt att förutsäga upptagshastigheten över olika växtarter eller utvecklingsstadier av samma art. Detta kan komplicera experiment om föreningens upptagshastighet är en begränsande faktor. För bästa resultat bör experiment planeras så att tillräcklig tid ges för att växten helt ska absorbera 2,5 ml förening, vilket kan ta upp till 1 vecka. Sammanfattningsvis är denna DPI-anordning ett effektivt verktyg för snabb utvärdering av den in planta-aktiviteten hos antimikrobiella eller insekticida föreningar mot CLas och dess vektor, D. citri, vilket ger mer information om systemisk effektivitet och påverkan på växtprestanda än den tidigare presenterade fristående bladanalysen23. Utan tvekan når mångfalden av applikationer för detta system långt utöver de specifika användningsområden som beskrivs i denna studie.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Mant Acon för de växter som används i denna studie. Finansieringen tillhandahölls av US Department of Agriculture (USDA) CRIS-projekt 8062-22410-007-000-D och USDA NIFA-bidrag 2020-70029-33176.
0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
Parafilm | Bemis | HS234526A | |
Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |