Dans l'imagerie in situ de la souris en utilisant deux Thymus microscopie biphotonique
Summary
Nous présentons, étape par étape les instructions pour la génération des chimères néonatale ainsi que la dissection et la préparation du thymus pour l'imagerie ex vivo par microscopie biphotonique 2.
Abstract
Microscopie à deux photons (TPM) nous permet de l'image en profondeur dans le thymus et de documenter les événements qui sont importants pour le développement des thymocytes. Pour suivre la migration des individus dans une foule de thymocytes, nous générons des chimères néonatale où moins de un pour cent des thymocytes sont issus d'un donneur qui est transgénique pour une protéine ubiquitaire expresse fluorescentes. Pour générer ces chimères hématopoïétiques partielle, les bénéficiaires néonatale sont injectés avec de la moelle osseuse entre 3-7 jours d'âge. Après 4-6 semaines, la souris est sacrifiée et le thymus est soigneusement disséquée et bissected préservant l'architecture du tissu qui sera imagé. Le thymus est collé sur une lamelle en préparation pour l'imagerie ex vivo par TPM. Pendant l'imagerie du thymus est conservé dans du DMEM sans rouge de phénol qui est perfusé avec 95% d'oxygène et de dioxyde de carbone de 5% et chauffé à 37 ° C. En utilisant cette approche, nous pouvons étudier les événements requis pour la génération d'un répertoire des cellules T diverses.
Protocol
Discussion
L'imagerie à deux photons dans le thymus nous permet d'examiner dans la vie, les organes intacts les interactions et les migrations qui sous-tendent les épreuves de sélection dans le thymus.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Matt Paul et Jimmy Wu pour l'assistance technique.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
