تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي
Summary
هنا ، نعرض بروتوكولا محسنا قائما على مضان BODIPY 493/503 لتوصيف قطرات الدهون في أنسجة الكبد. من خلال استخدام الإسقاطات المتعامدة وإعادة البناء 3D ، يسمح الفلوروفور بالتمييز الناجح بين التنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير وقد يمثل نهجا تكميليا للبروتوكولات النسيجية الكلاسيكية لتقييم التنكس الدهني الكبدي.
Abstract
قطرات الدهون (LDs) هي عضيات متخصصة تتوسط في تخزين الدهون وتلعب دورا مهما للغاية في قمع السمية الدهنية ومنع الخلل الوظيفي الناجم عن الأحماض الدهنية الحرة (FAs). الكبد ، نظرا لدوره الحاسم في استقلاب الدهون في الجسم ، مهدد باستمرار من خلال تراكم LDs داخل الخلايا في شكل تنكس دهني كبدي حويصلي وكبير. يعتمد التوصيف النسيجي ل LDs عادة على أصباغ ديازو القابلة للذوبان في الدهون ، مثل تلطيخ Oil Red O (ORO) ، ولكن هناك عددا من العيوب التي تعيق باستمرار استخدام هذا التحليل مع عينات الكبد. في الآونة الأخيرة ، أصبحت الفلوروفورات المحبة للدهون 493/503 شائعة لتصور وتحديد موقع LDs بسبب امتصاصها السريع وتراكمها في قلب قطرات الدهون المحايدة. على الرغم من أن معظم التطبيقات موصوفة جيدا في مزارع الخلايا ، إلا أن هناك أدلة أقل تثبت الاستخدام الموثوق لتحقيقات الفلوروفور المحبة للدهون كأداة تصوير LD في عينات الأنسجة. هنا ، نقترح بروتوكولا محسنا قائما على ثنائي بيروميثين البورون (BODIPY) 493/503 لتقييم LDs في عينات الكبد من نموذج حيواني لنظام غذائي عالي الدهون (HFD) الناجم عن تنكس دهني كبدي. يغطي هذا البروتوكول تحضير عينات الكبد ، وتقسيم الأنسجة ، وتلطيخ BODIPY 493/503 ، والحصول على الصور ، وتحليل البيانات. لقد أظهرنا زيادة في عدد وشدة ونسبة المساحة وقطر LDs الكبدية عند تغذية HFD. باستخدام الإسقاطات المتعامدة وإعادة البناء 3D ، كان من الممكن مراقبة المحتوى الكامل للدهون المحايدة في قلب LD ، والتي ظهرت على شكل قطرات كروية تقريبا. علاوة على ذلك ، مع الفلوروفور BODIPY 493/503 ، تمكنا من التمييز بين الحويصلات الدقيقة (1 ميكرومتر < د ≤ 3 ميكرومتر) ، والحويصلات الوسيطة (3 ميكرومتر 9 ميكرومتر) ، مما يسمح بالتمييز الناجح للتنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير . بشكل عام ، يعد هذا البروتوكول القائم على مضان BODIPY 493/503 أداة موثوقة وبسيطة لتوصيف LD الكبدي وقد يمثل نهجا تكميليا للبروتوكولات النسيجية الكلاسيكية.
Introduction
قطرات الدهون (LDs) ، التي ينظر إليها تقليديا على أنها مستودعات للطاقة ، هي عضيات خلوية متخصصة تتوسط في تخزين الدهون ، وهي تتألف من نواة دهنية محايدة كارهة للماء ، والتي تحتوي بشكل أساسي على استرات الكوليسترول والدهون الثلاثية (TGs) ، مغلفة بطبقة أحادية فوسفوليبيد1،2،3.
يحدث التكوين الحيوي LD في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، بدءا من تخليق ثلاثي الجلسرين (TAG) واسترات الستيرول. تنتشر الدهون المحايدة بين وريقات الطبقة المزدوجة ER بتركيزات منخفضة ولكنها تتجمع في عدسات زيتية تنمو وتنبت في قطرات كروية تقريبا من غشاء ER عندما يزيد تركيزها داخل الخلايا4. بعد ذلك ، تنتقل البروتينات من طبقة ER المزدوجة والعصارة الخلوية ، وخاصة عائلة بروتين perilipin (PLIN) ، إلى أسطح LDs لتسهيل التبرعم5،6،7،8،9.
من خلال تخليق الأحماض الدهنية الجديدة واندماج LD أو الاندماج ، تنمو LDs إلى أحجام مختلفة. وفقا لذلك ، يختلف حجم وعدد LDs اختلافا كبيرا عبر أنواع الخلايا المختلفة. يمكن تشكيل قطرات صغيرة (قطرها 300-800 نانومتر) ، والتي تعرف باسم LDs الأولية (iLDs) ، بواسطة جميع الخلايا4 تقريبا. في وقت لاحق من تكوين LD ، تكون معظم الخلايا قادرة على تحويل بعض iLDs إلى LDs أكبر حجما (قطرها > 1 ميكرومتر). ومع ذلك ، فإن أنواعا معينة فقط من الخلايا ، مثل الخلايا الشحمية وخلايا الكبد ، لديها القدرة على تكوين LDs عملاقة أو كبيرة الحجم (يصل قطرها إلى عشرات الميكرونات)4,10.
تلعب LDs دورا مهما جدا في تنظيم استقلاب الدهون الخلوية ، وقمع السمية الدهنية ، ومنع إجهاد ER ، واختلال وظائف الميتوكوندريا ، وفي النهاية موت الخلايا الناجم عن الأحماض الدهنية الحرة (FAs) 11،12،13،14. علاوة على ذلك ، تورطت LDs أيضا في تنظيم التعبير الجيني ، وعزل بروتين التكاثر الفيروسي ، والاتجار بالأغشية والإشارة15،16،17. لذلك ، فإن سوء تنظيم التكوين الحيوي LD هو السمة المميزة للأمراض المزمنة المرتبطة بمتلازمة التمثيل الغذائي ، والسمنة ، وداء السكري من النوع 2 (T2DM) ، و / أو تصلب الشرايين ، على سبيل المثال لا الحصر18،19،20.
الكبد ، كمركز استقلابي ، مسؤول في الغالب عن استقلاب الدهون عن طريق تخزين ومعالجة الدهون ، وبالتالي ، فهو مهدد باستمرار بالسمية الدهنية21. التنكس الدهني الكبدي (HS) هو سمة شائعة لسلسلة من أمراض الكبد التقدمية ويتميز بتراكم الدهون المفرط داخل الخلايا في شكل LDs الخلوية التي قد تؤدي في النهاية إلى خلل وظيفي في التمثيل الغذائي في الكبد ، والتهاب ، وأشكال متقدمة من مرض الكبد الدهني غير الكحولي22،23،24،25. يحدث HS عندما يكون معدل أكسدة الأحماض الدهنية وتصديرها كدهون ثلاثية داخل البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (VLDLs) أقل من معدل امتصاص الأحماض الدهنية الكبدية من البلازما وتخليق الأحماض الدهنية الجديدة 26. غالبا ما يحدث التراكم الكبدي للدهون في شكلين – التنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير – وهذه تظهر خصائص معمارية خلوية مميزة27. عادة ، يتميز التنكس الدهني الحويصلي الدقيق بوجود LDs صغيرة منتشرة في جميع أنحاء خلية الكبد مع وضع النواة مركزيا ، في حين يتميز التنكس الدهني الحويصلي الكبير بوجود LD كبير واحد يحتل الجزء الأكبر من خلية الكبد ، مما يدفع النواة إلى المحيط28,29. والجدير بالذكر أن هذين النوعين من التنكس الدهني غالبا ما يتم العثور عليهما معا ، ولا يزال من غير الواضح كيف يؤثر هذان النمطان من LD على التسبب في المرض ، حيث لا تزال الأدلة غير متسقة31،32،33،34. ومع ذلك ، غالبا ما يستخدم هذا النوع من التحليل ك “معيار مرجعي” في الدراسات قبل السريرية والسريرية لفهم السلوك الديناميكي ل LDs وتوصيف التنكس الدهني الكبدي29،34،35،36.
يتم تقييم خزعات الكبد ، المعيار الذهبي لتشخيص وتصنيف HS ، بشكل روتيني عن طريق تحليل الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) النسيجي ، حيث يتم تقييم قطرات الدهون على أنها فجوات غير ملوثة في أقسام الكبد الملطخة H&E37. في حين أنه مقبول لتقييم التنكس الدهني الحويصلي الكبير ، فإن هذا النوع من التلوين يضيق عموما تقييم التنكس الدهني الحويصليالدقيق 38. يتم دمج أصباغ ديازو القابلة للذوبان في الدهون ، مثل Oil Red O (ORO) ، بشكل كلاسيكي مع الفحص المجهري برايتفيلد لتحليل مخازن الدهون داخل الخلايا ، ولكن لا يزال لها عدد من العيوب: (i) استخدام الإيثانول أو الأيزوبروبانول في عملية التلوين ، والتي غالبا ما تسبب تعطيل LDs الأصلية والانصهار العرضي على الرغم من إصلاح الخلايا39; (ii) الطبيعة المستهلكة للوقت ، حيث يتطلب محلول ORO إذابة مسحوق طازج وترشيحه بسبب مدة الصلاحية المحدودة ، مما يساهم في نتائج أقل اتساقا ؛ (iii) وحقيقة أن ORO يلطخ أكثر من مجرد قطرات دهنية وغالبا ما يبالغ في تقدير التنكس الدهني الكبدي38.
وبالتالي ، تم استخدام الفلوروفورات المحبة للدهون المنفذة للخلايا ، مثل النيل الأحمر ، إما في عينات حية أو ثابتة للتغلب على بعض القيود المذكورة أعلاه. ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير المحددة لوضع العلامات على عضيات الدهون الخلوية تضيق مرارا وتكرارا تقييمات LD40. علاوة على ذلك ، تختلف الخصائص الطيفية لأحمر النيل وفقا لقطبية البيئة ، والتي يمكن أن تؤدي في كثير من الأحيان إلى تحولات طيفية41.
مسبار الفلورسنت المحب للدهون 1،3،5،7،8-خماسي ميثيل-4-بورا-3a، 4adiaza-s-indacene (الطول الموجي للإثارة: 480 نانومتر ؛ الحد الأقصى للانبعاث: 515 نانومتر ؛ BODIPY 493/503) خصائص الكارهة للماء التي تسمح بامتصاصه السريع بواسطة LDs داخل الخلايا ، ويتراكم في قلب قطرات الدهون ، وبالتالي ينبعث منه مضان أخضر فاتح12. على عكس النيل الأحمر ، فإن BODIPY 493/503 غير حساس لقطبية البيئة وقد ثبت أنه أكثر انتقائية ، لأنه يعرض سطوعا عاليا لتصوير LD. من أجل تلطيخ LDs المحايدة ، يمكن استخدام هذه الصبغة في الخلايا الحية أو الثابتة وتقترن بنجاح بطرق تلطيخ و / أو وضع العلامات الأخرى42. ميزة أخرى للصبغة هي أنها تتطلب القليل من الجهد لوضعها في محلول ومستقرة ، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى إعدادها حديثا لكل تجربة42. على الرغم من أن مسبار BODIPY 493/503 قد تم استخدامه بنجاح لتصور توطين وديناميكيات LDs في مزارع الخلايا ، فقد أظهرت بعض التقارير أيضا الاستخدام الموثوق لهذه الصبغة كأداة تصوير LD في الأنسجة بما في ذلك عضلة الأوعية الدموية البشرية43 ، وعضلة الفئران الوحيدة 42 ، وأمعاء الفأر44.
هنا ، نقترح بروتوكولا محسنا قائما على BODIPY 493/503 كنهج تحليلي بديل لتقييم رقم LD ومساحته وقطره في عينات الكبد من نموذج حيواني للتنكس الدهني الكبدي. يغطي هذا الإجراء تحضير عينة الكبد ، وتقسيم الأنسجة ، وظروف التلوين ، والحصول على الصور ، وتحليل البيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يهدف هذا البروتوكول القائم على مضان BODIPY 493/503 لتقييم LD إلى تطوير نهج تصوير جديد لتقييم التنكس الدهني الكبدي. نظرا للعلاقة القوية بين السمنة وأمراض الكبد الدهنية ، تم استخدام النظام الغذائي عالي الدهون على النمط الغربي لإنشاء نموذج حيواني للتنكس الدهني الكبدي26. تم تأكيد زيادة ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل الصناديق الوطنية والأوروبية عبر مؤسسة العلوم والتكنولوجيا البرتغالية (FCT) ، والصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (FEDER) ، وبرنامج العوامل التشغيلية للمنافسة (COMPETE): 2020.09481.BD ، UIDP / 04539/2020 (CIBB) ، و POCI-01-0145-FEDER-007440. يود المؤلفون أن يشكروا دعم iLAB – مختبر الفحص المجهري والتصوير الحيوي ، وهو مرفق تابع لكلية الطب بجامعة كويمبرا وعضو في البنية التحتية الوطنية PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122) ، بالإضافة إلى الدعم من FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
Materials
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors – 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
References
- Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
- Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
- Thiele, C., Penno, A., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. , 273-278 (2016).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Jackson, C. L. Lipid droplet biogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 59, 88-96 (2019).
- Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128 (2017).
- Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R., Yang, H., Li, P. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. , 107-127 (2013).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , (2007).
- Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
- Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
- Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
- Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
- Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224 (2022).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
- Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
- Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
- Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
- Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
- Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
- Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
- Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
- Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J., Muriel, P. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. , 23-44 (2017).
- Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
- Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
- Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
- Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
- Hübscher, S. G., Saxena, R. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). , 371-390 (2018).
- Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242 (2018).
- Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
- de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
- Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P. What’s new in hepatic steatosis. Seminars in Ultrasound, CT and MRI. 42 (4), 405-415 (2021).
- Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092 (2012).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42 (2015).
- Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774 (2013).
- Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808 (2020).
- Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
- Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
- Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718 (2022).
- Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
- Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849 (2022).
