Uso do MouseWalker para Quantificar a Disfunção Locomotora em um Modelo de Lesão Medular em Camundongos

Summary

Um pipeline experimental para descrever quantitativamente o padrão locomotor de camundongos que caminham livremente usando a caixa de ferramentas MouseWalker (MW) é fornecido, variando de gravações de vídeo iniciais e rastreamento até análise pós-quantificação. Um modelo de lesão por contusão medular em camundongos é empregado para demonstrar a utilidade do sistema MW.

Abstract

A execução de programas motores complexos e de alta coordenação, como caminhada e corrida, é dependente da ativação rítmica dos circuitos espinhal e supra-espinhal. Após uma lesão medular torácica, a comunicação com os circuitos a montante é prejudicada. Isso, por sua vez, leva a uma perda de coordenação, com potencial de recuperação limitado. Assim, para melhor avaliar o grau de recuperação após a administração de fármacos ou terapias, há necessidade de novas ferramentas, mais detalhadas e precisas, para quantificar a marcha, a coordenação dos membros e outros aspectos finos do comportamento locomotor em modelos animais de lesão medular. Vários ensaios foram desenvolvidos ao longo dos anos para avaliar quantitativamente o comportamento de marcha livre em roedores; no entanto, eles geralmente carecem de medidas diretas relacionadas a estratégias de marcha escalonada, padrões de pegadas e coordenação. Para resolver essas deficiências, uma versão atualizada do MouseWalker, que combina uma passarela de reflexão interna total frustrada (fTIR) com software de rastreamento e quantificação, é fornecida. Este sistema de código aberto foi adaptado para extrair várias saídas gráficas e parâmetros cinemáticos, e um conjunto de ferramentas de pós-quantificação pode ser para analisar os dados de saída fornecidos. Este manuscrito também demonstra como esse método, aliado a testes comportamentais já estabelecidos, descreve quantitativamente déficits locomotores após lesão medular.

Introduction

A coordenação efetiva dos quatro membros não é exclusiva dos animais quadrúpedes. A coordenação membro torácico-membro pélvico em humanos continua sendo importante para a realização de diversas tarefas, como natação e alterações da velocidade durante a^marcha1. Vários programas^cinemáticos e motores^{dos membros2,3,4}, bem como circuitos de feedback proprioceptivo5, são conservados entre humanos e outros mamíferos e devem ser considerados quando se analisam opções terapêuticas para distúrbios motores, como a lesão medular (LM)6,7,8.

Para a deambulação, várias conexões espinhais dos membros torácicos e pélvicos precisam ser adequadamente conectadas e ativadas ritmicamente, o que requer inputs do cérebro e feedback do sistema somatossensorial 2,9,10. Essas conexões culminam nos geradores de padrão central (CPGs), que se situam em nível cervical e lombar para os membros torácicos e pélvicos, respectivamente ^1,9,10. Muitas vezes, após a LM, a ruptura da conectividade neuronal e a formação de uma cicatriz glial inibitória¹² limitam a recuperação da função locomotora, com desfechos que variam de paralisia total a função restrita de um grupo de membros, dependendo da gravidade da lesão. Ferramentas para quantificar com precisão a função locomotora após LM são fundamentais para monitorar a recuperação e avaliar os efeitos de tratamentos ou outras intervenções clínicas⁶.

O ensaio métrico padrão para modelos de contusão de camundongos com LM é a escala Basso de camundongos (BMS)^13,14, um escore não paramétrico que considera a estabilidade do tronco, a posição da cauda^, o passo plantar e a coordenação membros torácicos-membros posteriores em uma arena de campo aberto. Embora o SNF seja extremamente confiável para a maioria dos casos, ele requer pelo menos dois avaliadores experientes para observar todos os ângulos de movimento dos animais, a fim de explicar a variabilidade natural e reduzir o viés.

Outros ensaios também foram desenvolvidos para avaliar quantitativamente o desempenho motor após LMT. Estes incluem o teste de rotarod, que mede o tempo gasto em um cilindro giratório¹⁵; a escada horizontal, que mede o número de grades perdidas e pegas de escada positivas^16,17; e o teste de marcha em viga, que mede o tempo que um animal leva e o número de falhas que ele comete ao atravessar uma viga estreita¹⁸. Apesar de refletir uma combinação de déficits motores, nenhum desses testes produz informações locomotoras diretas sobre a coordenação entre membros torácicos.

Para analisar de forma específica e mais aprofundada o comportamento de caminhar, outros ensaios foram desenvolvidos para reconstruir ciclos de passos e estratégias de gaiting. Um exemplo é o teste da pegada (pegada), em que as patas pintadas de um animal desenham um padrão sobre uma folha de papel branco¹⁹. Embora simples em sua execução, a extração de parâmetros cinemáticos como o comprimento da passada é complicada e imprecisa. Além disso, a falta de parâmetros dinâmicos, como a duração do ciclo do passo ou a coordenação temporizada com as pernas, limita suas aplicações; Na verdade, esses parâmetros dinâmicos só podem ser adquiridos analisando vídeos quadro a quadro de roedores caminhando por uma superfície transparente. Para os estudos de LM, pesquisadores analisaram o comportamento da marcha em vista lateral utilizando esteira, incluindo a reconstrução do ciclo do passo e a mensuração das variações angulares de cada articulação da perna 4,20,21. Embora essa abordagem possa ser extremamente^informativa6, ela permanece focada em um conjunto específico de membros e carece de características adicionais da marcha, como coordenação.

Para preencher essas lacunas, Hamers e colaboradores desenvolveram um teste quantitativo baseado em um sensor de toque óptico usando reflexão interna total frustrada (fTIR)²². Neste método, a luz se propaga através do vidro através da reflexão interna, torna-se espalhada ao pressionar a pata e, finalmente, é capturada por uma câmera de alta velocidade. Mais recentemente, uma versão open-source desse método, denominada MouseWalker, foi disponibilizada, e essa abordagem combina uma passarela fTIR com um pacote de software de rastreamento e quantificação²³. Usando esse método, o usuário pode extrair um grande conjunto de parâmetros quantitativos, incluindo padrões de passo, espacial e de marcha, posicionamento da pegada e coordenação membro anterior-membro posterior, bem como saídas visuais, como padrões de impressão (imitando^{o ensaio 6} da pata com tinta) ou fases de apoio em relação ao eixo do corpo. É importante ressaltar que, devido à sua natureza de código aberto, novos parâmetros podem ser extraídos atualizando o pacote de script do MATLAB.

Aqui, o assembly publicado anteriormente do sistema MouseWalker²³ é atualizado. Uma descrição de como configurá-lo é fornecida, com todas as etapas necessárias para obter a melhor qualidade de vídeo, condições de rastreamento e aquisição de parâmetros. Ferramentas adicionais de pós-quantificação também são compartilhadas para aprimorar a análise do conjunto de dados de saída do MouseWalker (MW). Finalmente, a utilidade dessa ferramenta é demonstrada pela obtenção de valores quantificáveis para o desempenho locomotor geral, especificamente ciclos de passos e coordenação membro torácico-membro pélvico, em um contexto de lesão medular (LM).

Protocol

Todos os procedimentos de manuseamento, cirúrgicos e pós-operatórios foram aprovados pela Comissão Interna Molecular do Instituto de Medicina (ORBEA) e pela Comissão de Ética Animal (DGAV) de acordo com as diretrizes da Comunidade Europeia (Diretiva 2010/63/UE) e a lei portuguesa sobre cuidados com animais (DL 113/2013) sob a licença 0421/000/000/2022. Camundongos fêmeas C57Bl/6J com idade de 9 semanas foram utilizados para o presente estudo. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais e d…

Representative Results

O sistema padrão de SNF descreve os déficits motores grossos após LM14. Devido à sua natureza subjetiva, outros ensaios quantitativos são geralmente realizados ao lado do SNF para produzir uma avaliação mais detalhada e fina da locomoção. No entanto, esses testes falham em mostrar informações específicas sobre ciclos de passos, padrões de passos e coordenação membro torácico-membro pélvico, o que é extremamente importante para entender como o circuito espinhal mantém a função …

Discussion

Aqui, o potencial do método de MouseWalker é demonstrado pela análise do comportamento locomotor após LM. Ele fornece novos insights sobre alterações específicas nos padrões de pisada, pegada e marcha que, de outra forma, seriam perdidas por outros testes padrão. Além de fornecer uma versão atualizada do pacote MW, as ferramentas de análise de dados também são descritas usando os scripts Python fornecidos (consulte a etapa 5).

Como o MW gera um grande conjunto de dados e uma cole…

Materials

45º Mirror
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side	Misumi
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side	Misumi
1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long	Misumi
87 x 23 cm mirror	General glass supplier
black cardboard filler	General stationery supplier		We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror
Background backlight
109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick)	General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side	Misumi
multicolor LED strip	General hardware supplier
white opaque paper to cover the plexyglass	General stationery supplier
fTIR Support base and posts
2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height	Misumi
60 x 30 cm metric breadboard	Edmund Optics	#54-641
M6 12 mm screws	Edmund Optics
M6 hex nuts and wahers	Edmund Optics
fTIR Walkway
109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)	General hardware supplier		109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)
109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass)	General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side	Misumi
black cardboard filler	General stationery supplier		we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges
12 mm screws	Edmund Optics	M6
High speed camera (on a tripod)
Blackfly S USB3	Blackfly	USB3	This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second
Infinite Horizon Impactor
Infinite Horizon Impactor	Precision Systems and Instrumentation, LLC.
Lens
Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm	Nikkon	2.8-4D IF	This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals
Software
MATLAB R2022b	MathWorks
Python 3.9.13	Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4	Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5	Spyder Project Contributors
Walkway wall
2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm	Any bricolage convenience store
2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height	Any bricolage convenience store
GitHub Materials
Folder name	URL
Boxplots	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots		Script to create Boxplots
Docs	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs		Additional documents
Heatmap	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps		Script to create heatmap
Matlat script	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script		MouseWalker matlab script
PCA	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots		Script to perform Principal Component Analysis
Raw data Plots	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots		Script to create Raw data plots
Residual Analysis	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis		Code to compute residuals from Raw data