MouseWalker를 사용하여 척수 손상 마우스 모델에서 운동 기능 장애 정량화
Summary
마우스워커(MW) 툴박스를 사용하여 자유롭게 걷는 쥐의 운동 패턴을 정량적으로 설명하는 실험 파이프라인이 제공되며, 초기 비디오 녹화 및 추적에서 정량화 후 분석에 이르기까지 다양합니다. 생쥐의 척수 타박상 손상 모델은 MW 시스템의 유용성을 입증하기 위해 사용됩니다.
Abstract
걷기 및 달리기와 같은 복잡하고 고도로 조정 된 운동 프로그램의 실행은 척추 및 척추 상 회로의 리드미컬 한 활성화에 달려 있습니다. 흉부 척수 손상 후 업스트림 회로와의 통신이 손상됩니다. 이는 결국 조정 상실로 이어지고 회복 가능성이 제한됩니다. 따라서 약물이나 치료법 투여 후 회복 정도를 더 잘 평가하기 위해서는 척수 손상 동물 모델에서 보행, 사지 협응 및 기타 운동 행동의 미세한 측면을 정량화할 수 있는 새롭고 보다 상세하며 정확한 도구가 필요합니다. 설치류의 자유 보행 행동을 정량적으로 평가하기 위해 수년에 걸쳐 여러 분석법이 개발되었습니다. 그러나 일반적으로 보행 전략, 발자국 패턴 및 조정과 관련된 직접적인 측정이 부족합니다. 이러한 단점을 해결하기 위해 fTIR(Frustrated Total Internal Reflection) 통로와 추적 및 정량화 소프트웨어를 결합한 업데이트된 버전의 MouseWalker가 제공됩니다. 이 오픈 소스 시스템은 여러 그래픽 출력과 운동학적 매개변수를 추출하도록 조정되었으며 정량화 후 도구 세트는 제공된 출력 데이터를 분석할 수 있습니다. 이 원고는 또한 이미 확립된 행동 테스트와 결합된 이 방법이 척수 손상 후 운동 결손을 정량적으로 설명하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
네 팔다리의 효과적인 조정은 네 발 달린 동물에만 국한된 것이 아닙니다. 인간의 앞다리-뒷다리 협응력은 수영 및 걷는 동안 속도 변경과 같은 여러 작업을 수행하는 데 여전히 중요합니다1. 고유 수용성 피드백 회로(proprioceptive feedback circuit)5 뿐만 아니라, 다양한 사지 운동학(limb kinematic)2 및운동 프로그램(motor program)1,3,4은 인간과 다른 포유류 사이에서 보존되며, 척수 손상(SCI)6,7,8 과 같은 운동 장애에 대한 치료 옵션을 분석할 때 고려되어야 한다.
걷기 위해서는 앞다리와 뒷다리의 여러 척추 연결이 적절하게 연결되고 리드미컬하게 활성화되어야 하며, 이를 위해서는 뇌의 입력과 체성 감각 시스템의 피드백이 필요합니다 2,9,10. 이러한 연결은 각각 앞다리와 뒷다리의 경추 및 요추 수준에 위치한 중앙 패턴 생성기(CPG)에서 절정에 이릅니다1,9,10. 종종 SCI 후, 신경 연결성의 붕괴와 억제성 신경교 흉터(12)의 형성은 운동 기능의 회복을 제한하며, 결과는 손상 중증도에 따라 전체 마비에서 사지 그룹의 제한된 기능에 이르기까지 다양하다. SCI 후 운동 기능을 정확하게 정량화하는 도구는 회복을 모니터링하고 치료 또는 기타 임상 개입의 효과를 평가하는 데 중요합니다6.
SCI의 마우스 타박상 모델에 대한 표준 메트릭 분석은 Basso 마우스 척도(BMS)13,14로, 오픈 필드 경기장에서 몸통 안정성, 꼬리 위치, 발바닥 스테핑 및 앞다리-뒷다리 협응을 고려하는 비모수 점수입니다. BMS는 대부분의 경우 매우 신뢰할 수 있지만 자연 변동성을 설명하고 편향을 줄이기 위해 동물 움직임의 모든 각도를 관찰하려면 최소 두 명의 숙련된 평가자가 필요합니다.
SCI 후 운동 성능을 정량적으로 평가하기 위한 다른 분석법도 개발되었습니다. 이들은 회전 실린더(15)에 소요되는 시간을 측정하는 로타로드 테스트를 포함한다; 놓친 난간 수와 긍정적 인 사다리 잡기16,17의 수를 측정하는 수평 사다리; 그리고 동물이 좁은 빔을 건널 때 걸리는 시간과 실패 횟수를 측정하는 빔 워킹 테스트(18). 운동 결손의 조합을 반영함에도 불구하고 이러한 테스트 중 어느 것도 앞다리-뒷다리 협응에 대한 직접적인 운동 정보를 생성하지 않습니다.
보행 행동을 구체적이고 철저하게 분석하기 위해 보행 주기와 보행 전략을 재구성하기 위한 다른 분석법이 개발되었습니다. 한 가지 예는 동물의 잉크로 칠한 발이 흰 종이19 위에 패턴을 그리는 발자국 테스트입니다. 실행은 간단하지만 보폭과 같은 운동학적 매개변수를 추출하는 것은 번거롭고 부정확합니다. 또한, 스텝 사이클의 지속 시간 또는 레그 타임 조정과 같은 동적 매개변수의 부족은 적용을 제한합니다. 실제로 이러한 동적 매개변수는 투명한 표면을 통과하는 설치류의 프레임별 비디오를 분석해야만 얻을 수 있습니다. SCI 연구를 위해 연구자들은 걸음 주기를 재구성하고 각 다리 관절의 각도 변화를 측정하는 것을 포함하여 트레드밀을 사용하여 측면 보기에서 보행 행동을 분석했습니다 4,20,21. 이 접근법은 매우 유익할 수 있지만6, 특정 팔다리 세트에 초점을 맞추고 조정과 같은 추가적인 보행 기능이 부족하다.
이러한 격차를 메우기 위해 Hamers와 동료들은 좌절 된 내부 반사 (fTIR) 22를 사용하는 광학 터치 센서를 기반으로 정량적 테스트를 개발했습니다. 이 방법에서 빛은 내부 반사를 통해 유리를 통해 전파되고 발을 누르면 산란되어 마지막으로 고속 카메라로 캡처됩니다. 보다 최근에, 마우스워커(MouseWalker)라고 불리는 이 방법의 오픈 소스 버전이 이용가능하게 되었고, 이 접근법은 fTIR 통로를 추적 및 정량화 소프트웨어 패키지(23)와 결합한다. 이 방법을 사용하여 사용자는 걸음 수, 공간 및 보행 패턴, 발자국 위치 지정, 앞다리-뒷다리 협응을 포함한 많은 정량적 매개변수뿐만 아니라 발자국 패턴(잉크 발 분석6 모방) 또는 신체 축에 대한 자세 단계와 같은 시각적 출력을 추출할 수 있습니다. 중요한 것은 오픈 소스 특성으로 인해 MATLAB 스크립트 패키지를 업데이트하여 새로운 파라미터를 추출할 수 있다는 것입니다.
여기에서 이전에 게시된 MouseWalker23 시스템 어셈블리가 업데이트됩니다. 최상의 비디오 품질, 추적 조건 및 매개변수 획득을 달성하는 데 필요한 모든 단계와 함께 설정 방법에 대한 설명이 제공됩니다. MouseWalker(MW) 출력 데이터 세트의 분석을 향상시키기 위해 추가 사후 정량화 도구도 공유됩니다. 마지막으로, 이 도구의 유용성은 척수 손상(SCI) 맥락에서 일반적인 운동 성능, 특히 보행 주기 및 앞다리-뒷다리 협응에 대한 정량화 가능한 값을 얻음으로써 입증됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 MouseWalker 방법의 잠재력은 SCI 후 운동 행동을 분석하여 입증됩니다. 다른 표준 테스트에서는 놓칠 수 있는 걸음 걸기, 발자국 및 보행 패턴의 특정 변경에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. MW 패키지의 업데이트된 버전을 제공하는 것 외에도 제공된 Python 스크립트를 사용하여 데이터 분석 도구에 대해 설명합니다(5단계 참조).
MW가 대규모 데이터 세트와 고차원 운동…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Laura Tucker와 Natasa Loncarevic에게 원고에 대한 의견과 Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes의 설치류 시설에서 제공 한 지원에 감사드립니다. 저자는 Prémios Santa Casa Neurociências – 척수 손상 연구 상 Melo e Castro(MC-36/2020)가 LS 및 CSM에 대한 재정 지원을 인정하고자 합니다. 이 작업은 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 및 UIDP/04462/2020) 및 LS4FUTURE (LA/P/0087/2020)에서 C.S.M. L.S.는 CEEC Individual Principal Investigator 계약(2021.02253.CEECIND)에 의해 지원되었습니다. AFI는 FCT (2020.08168.BD)의 박사 학위의 지원을 받았습니다. AMM은 FCT의 박사 과정 (PD / BD / 128445 / 2017)의 지원을 받았습니다. IM은 FCT(SFRH/BPD/118051/2016)의 박사후 연구원의 지원을 받았습니다. DNS는 FCT(SFRH/BD/138636/2018)의 박사 펠로우십의 지원을 받았습니다.
Materials
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| 12 mm screws | Edmund Optics | M6 | |
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | Blackfly | USB3 | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | ||
| Lens | |||
| Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikkon | 2.8-4D IF | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
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