En eksperimentell rørledning for kvantitativt å beskrive det lokomotoriske mønsteret til fritt gående mus ved hjelp av MouseWalker (MW) verktøykasse er gitt, alt fra innledende videoopptak og sporing til postkvantifiseringsanalyse. En ryggmargskontusjonsskademodell hos mus brukes til å demonstrere nytten av MW-systemet.
Gjennomføringen av komplekse og høyt koordinerte motoriske programmer, som å gå og løpe, er avhengig av rytmisk aktivering av spinal- og supra-spinalkretser. Etter en thorax ryggmargsskade er kommunikasjonen med oppstrøms kretser svekket. Dette fører igjen til tap av koordinering, med begrenset utvinningspotensial. Derfor, for bedre å evaluere graden av utvinning etter administrering av legemidler eller terapier, er det behov for nye, mer detaljerte og nøyaktige verktøy for å kvantifisere gange, lemkoordinering og andre fine aspekter av lokomotorisk oppførsel i dyremodeller av ryggmargsskade. Flere analyser har blitt utviklet gjennom årene for å kvantitativt vurdere frittgående oppførsel hos gnagere; Imidlertid mangler de vanligvis direkte målinger relatert til trinnvise gangstrategier, fotavtrykksmønstre og koordinering. For å løse disse manglene, tilbys en oppdatert versjon av MouseWalker, som kombinerer en frustrert total intern refleksjon (fTIR) gangvei med sporings- og kvantifiseringsprogramvare. Dette open source-systemet er tilpasset for å trekke ut flere grafiske utganger og kinematiske parametere, og et sett med postkvantifiseringsverktøy kan være å analysere utdataene. Dette manuskriptet viser også hvordan denne metoden, alliert med allerede etablerte atferdstester, kvantitativt beskriver bevegelsesutfall etter ryggmargsskade.
Den effektive koordineringen av fire lemmer er ikke unik for quadruped dyr. Forben-baklem-koordinasjon hos mennesker er fortsatt viktig for å utføre flere oppgaver, for eksempel svømming og hastighetsendringer mens du går1. Ulike lem kinematisk2 og motorprogram 1,3,4, samt proprioceptive tilbakemeldingskretser5, er konservert mellom mennesker og andre pattedyr og bør vurderes ved analyse av terapeutiske alternativer for motoriske lidelser, som ryggmargsskade (SCI) 6,7,8.
For å kunne gå, må flere spinalforbindelser fra forben og baklemmer være riktig kablet og rytmisk aktivert, noe som krever innganger fra hjernen og tilbakemelding fra det somatosensoriske systemet 2,9,10. Disse forbindelsene kulminerer i de sentrale mønstergeneratorene (CPG), som ligger på livmorhals- og lumbalnivå for forbenene og baklemmene, henholdsvis 1,9,10. Ofte, etter SCI, begrenser forstyrrelsen av nevronal tilkobling og dannelsen av et hemmende glialarr12 gjenopprettingen av lokomotorisk funksjon, med utfall som varierer fra total lammelse til begrenset funksjon av en gruppe lemmer avhengig av skadens alvorlighetsgrad. Verktøy for presis kvantifisering av bevegelsesfunksjon etter ryggmargsskade er avgjørende for å overvåke tilfriskning og evaluere effekten av behandlinger eller andre kliniske intervensjoner6.
Standard metrisk analyse for musekontusjonsmodeller av SCI er Basso-museskalaen (BMS) 13,14, en ikke-parametrisk poengsum som vurderer stammestabilitet, haleposisjon, plantartrapping og forben-bakben-koordinering i en åpen feltarena. Selv om BMS er ekstremt pålitelig i de fleste tilfeller, krever det minst to erfarne ratere å observere alle vinkler av dyrs bevegelse for å ta hensyn til naturlig variabilitet og redusere skjevhet.
Andre analyser er også utviklet for å vurdere motorens ytelse etter SCI kvantitativt. Disse inkluderer rotarod-testen, som måler tid brukt på en roterende sylinder15; den horisontale stigen, som måler antall tapte rekkverk og positiv stige griper16,17; og strålegangtesten, som måler tiden et dyr tar og antall feil det gjør når det krysser en smal bjelke18. Til tross for at de reflekterer en kombinasjon av motoriske underskudd, gir ingen av disse testene direkte lokomotorisk informasjon om koordinering mellom forben og baklem.
For å spesifikt og grundigere analysere gangadferd, har andre analyser blitt utviklet for å rekonstruere trinnsykluser og gangstrategier. Et eksempel er fotavtrykkstesten, der de blekkede potene til et dyr tegner et mønster over et ark med hvitt papir19. Selv om det er enkelt i utførelsen, er det tungvint og unøyaktig å trekke ut kinematiske parametere som skrittlengde. Videre begrenser mangelen på dynamiske parametere, for eksempel varigheten av trinnsyklusen eller koordinering av ben, dens applikasjoner; Faktisk kan disse dynamiske parametrene bare kjøpes ved å analysere ramme-for-ramme-videoer av gnagere som går gjennom en gjennomsiktig overflate. For SCI-studier har forskere analysert gangadferd fra en lateral visning ved hjelp av tredemølle, inkludert rekonstruksjon av trinnsyklusen og måling av vinkelvariasjonene i hvert benledd 4,20,21. Selv om denne tilnærmingen kan være ekstremt informativ6, forblir den fokusert på et bestemt sett med lemmer og mangler ekstra gangfunksjoner, for eksempel koordinering.
For å fylle disse hullene utviklet Hamers og kolleger en kvantitativ test basert på en optisk berøringssensor ved hjelp av frustrert total intern refleksjon (fTIR)22. I denne metoden forplanter lyset seg gjennom glass via intern refleksjon, blir spredt ved potepressing, og til slutt fanges det av et høyhastighetskamera. Mer nylig ble en åpen kildekode-versjon av denne metoden, kalt MouseWalker, gjort tilgjengelig, og denne tilnærmingen kombinerer en fTIR-gangvei med en sporings- og kvantifiseringsprogramvarepakke23. Ved hjelp av denne metoden kan brukeren trekke ut et stort sett med kvantitative parametere, inkludert trinn-, rom- og gangmønstre, fotavtrykksposisjonering og koordinering av forben-baklemmer, samt visuelle utganger, for eksempel fotavtrykkmønstre (etterligne blekkpoteanalysen6) eller holdningsfaser i forhold til kroppsaksen. Viktigere, på grunn av sin åpen kildekode-natur, kan nye parametere trekkes ut ved å oppdatere MATLAB-skriptpakken.
Her oppdateres den tidligere publiserte samlingen av MouseWalker23-systemet . Det gis en beskrivelse av hvordan du konfigurerer den, med alle trinnene som kreves for å oppnå best mulig videokvalitet, sporingsforhold og parameterinnhenting. Ytterligere postkvantifiseringsverktøy deles også for å forbedre analysen av MouseWalker (MW) utgangsdatasett. Til slutt demonstreres nytten av dette verktøyet ved å oppnå kvantifiserbare verdier for generell lokomotorisk ytelse, spesielt trinnsykluser og koordinering av forben-baklemmer, i en ryggmargsskade (SCI) kontekst.
Her demonstreres potensialet til MouseWalker-metoden ved å analysere lokomotorisk oppførsel etter SCI. Det gir ny innsikt i spesifikke endringer i stepping, fotavtrykk og gangmønstre som ellers ville bli savnet av andre standardtester. I tillegg til å gi en oppdatert versjon av MW-pakken, beskrives også dataanalyseverktøy ved hjelp av de medfølgende Python-skriptene (se trinn 5).
Siden MW genererer et stort datasett og en samling kinematiske parametere som reflekterer en høydimensjonal…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Laura Tucker og Natasa Loncarevic for deres kommentarer til manuskriptet og støtten gitt av Rodent Facility ved Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Forfatterne ønsker å anerkjenne økonomisk støtte fra Prémios Santa Casa Neurociências – Prize Melo e Castro for Spinal Cord Injury Research (MC-36/2020) til LS og CSM Dette arbeidet ble støttet av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 og UIDP/04462/2020), og LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) til C.S.M. L.S. ble støttet av en CEEC Individual Principal Investigator-kontrakt (2021.02253.CEECIND). AFI ble støttet av et doktorgradsstipend fra FCT (2020.08168.BD). A.M.M. ble støttet av en doktorgradsstipendiat fra FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. ble støttet av et postdoktorstipend fra FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. ble støttet av en doktorgradsstipendiat fra FCT (SFRH/BD/138636/2018).
45º Mirror | |||
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
Background backlight | |||
109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
fTIR Support base and posts | |||
2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
fTIR Walkway | |||
109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
12 mm screws | Edmund Optics | M6 | |
High speed camera (on a tripod) | |||
Blackfly S USB3 | Blackfly | USB3 | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
Infinite Horizon Impactor | |||
Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | ||
Lens | |||
Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikkon | 2.8-4D IF | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
Software | |||
MATLAB R2022b | MathWorks | ||
Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
Walkway wall | |||
2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
GitHub Materials | |||
Folder name | URL | ||
Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |