Uso del MouseWalker para cuantificar la disfunción locomotora en un modelo de ratón de lesión de la médula espinal
Summary
Se proporciona una tubería experimental para describir cuantitativamente el patrón locomotor de ratones que caminan libremente utilizando la caja de herramientas MouseWalker (MW), que va desde grabaciones de video iniciales y seguimiento hasta análisis posteriores a la cuantificación. Se emplea un modelo de lesión por contusión de la médula espinal en ratones para demostrar la utilidad del sistema MW.
Abstract
La ejecución de programas motores complejos y altamente coordinados, como caminar y correr, depende de la activación rítmica de los circuitos espinales y supraespinales. Después de una lesión de la médula espinal torácica, la comunicación con los circuitos aguas arriba se ve afectada. Esto, a su vez, conduce a una pérdida de coordinación, con un potencial de recuperación limitado. Por lo tanto, para evaluar mejor el grado de recuperación después de la administración de medicamentos o terapias, existe la necesidad de herramientas nuevas, más detalladas y precisas para cuantificar la marcha, la coordinación de las extremidades y otros aspectos finos del comportamiento locomotor en modelos animales de lesión de la médula espinal. A lo largo de los años se han desarrollado varios ensayos para evaluar cuantitativamente el comportamiento de caminar libremente en roedores; Sin embargo, generalmente carecen de mediciones directas relacionadas con las estrategias de marcha por pasos, los patrones de huella y la coordinación. Para abordar estas deficiencias, se proporciona una versión actualizada del MouseWalker, que combina una pasarela de reflexión interna total frustrada (fTIR) con software de seguimiento y cuantificación. Este sistema de código abierto se ha adaptado para extraer varias salidas gráficas y parámetros cinemáticos, y un conjunto de herramientas de post-cuantificación puede ser para analizar los datos de salida proporcionados. Este manuscrito también demuestra cómo este método, aliado con pruebas de comportamiento ya establecidas, describe cuantitativamente los déficits locomotores después de una lesión de la médula espinal.
Introduction
La coordinación efectiva de cuatro extremidades no es exclusiva de los animales cuadrúpedos. La coordinación extremidad anterior-extremidad posterior en humanos sigue siendo importante para realizar varias tareas, como nadar y alteraciones de la velocidad al caminar1. Varios cinemáticos2 y del programa motor 1,3,4 de las extremidades, así como circuitos de retroalimentación propioceptiva5, se conservan entre humanos y otros mamíferos y deben ser considerados al analizar las opciones terapéuticas para los trastornos motores, como la lesión de la médula espinal (LME)6,7,8.
Para caminar, varias conexiones espinales de las extremidades anteriores y posteriores necesitan ser correctamente cableadas y activadas rítmicamente, lo que requiere aportes del cerebro y retroalimentación del sistema somatosensorial 2,9,10. Estas conexiones culminan en los generadores de patrones centrales (GPC), que están situados a nivel cervical y lumbar para las extremidades anteriores y posteriores, respectivamente 1,9,10. A menudo, después de la LME, la interrupción de la conectividad neuronal y la formación de una cicatriz glial inhibitoria12 limitan la recuperación de la función locomotora, con resultados que varían desde la parálisis total hasta la función restringida de un grupo de extremidades dependiendo de la gravedad de la lesión. Las herramientas para cuantificar con precisión la función locomotora después de la LME son críticas para monitorear la recuperación y evaluar los efectos de los tratamientos u otras intervenciones clínicas6.
El ensayo métrico estándar para los modelos de contusión de LME en ratones es la escala de ratón de Basso (BMS)13,14, una puntuación no paramétrica que considera la estabilidad del tronco, la posición de la cola, el paso plantar y la coordinación extremidad anterior-extremidad posterior en un campo abierto. A pesar de que el BMS es extremadamente confiable para la mayoría de los casos, requiere al menos dos evaluadores experimentados para observar todos los ángulos de movimiento de los animales para tener en cuenta la variabilidad natural y reducir el sesgo.
También se han desarrollado otros ensayos para evaluar cuantitativamente el rendimiento motor después de la SCI. Estos incluyen la prueba de rotarod, que mide el tiempo empleado en un cilindro giratorio15; la escalera horizontal, que mide el número de barandillas perdidas y la escalera positiva agarra16,17; y la prueba de marcha del haz, que mide el tiempo que tarda un animal y el número de fallos que comete al cruzar una viga estrecha18. A pesar de reflejar una combinación de déficits motores, ninguna de estas pruebas produce información locomotora directa sobre la coordinación extremidad anterior-extremidad posterior.
Para analizar específicamente y más a fondo el comportamiento al caminar, se han desarrollado otros ensayos para reconstruir los ciclos de pasos y las estrategias de marcha. Un ejemplo es la prueba de huella, donde las patas entintadas de un animal dibujan un patrón sobre una hoja de papel blanco19. Aunque simple en su ejecución, extraer parámetros cinemáticos como la longitud de zancada es engorroso e inexacto. Además, la falta de parámetros dinámicos, como la duración del ciclo escalonado o la coordinación cronometrada, limita sus aplicaciones; De hecho, estos parámetros dinámicos solo se pueden adquirir analizando videos cuadro por cuadro de roedores caminando a través de una superficie transparente. Para los estudios de SCI, los investigadores han analizado el comportamiento al caminar desde una vista lateral utilizando una cinta de correr, incluida la reconstrucción del ciclo de pasos y la medición de las variaciones angulares de cada articulación de la pierna 4,20,21. A pesar de que este enfoque puede ser extremadamente informativo6, sigue centrado en un conjunto específico de extremidades y carece de características adicionales de la marcha, como la coordinación.
Para llenar estos vacíos, Hamers y sus colegas desarrollaron una prueba cuantitativa basada en un sensor táctil óptico utilizando la reflexión interna total frustrada (fTIR)22. En este método, la luz se propaga a través del vidrio a través de la reflexión interna, se dispersa al presionar la pata y, finalmente, es capturada por una cámara de alta velocidad. Más recientemente, se puso a disposición una versión de código abierto de este método, llamada MouseWalker, y este enfoque combina una pasarela fTIR con un paquete de software de seguimiento y cuantificación23. Con este método, el usuario puede extraer un gran conjunto de parámetros cuantitativos, incluidos patrones de paso, espaciales y de marcha, posicionamiento de la huella y coordinación extremidad anterior-extremidad posterior, así como salidas visuales, como patrones de huella (imitando el ensayo de pata entintada6) o fases de postura relativas al eje del cuerpo. Es importante destacar que, debido a su naturaleza de código abierto, se pueden extraer nuevos parámetros actualizando el paquete de scripts de MATLAB.
Aquí, se actualiza el ensamblaje publicado anteriormente del sistema MouseWalker23 . Se proporciona una descripción de cómo configurarlo, con todos los pasos necesarios para lograr la mejor calidad de video, condiciones de seguimiento y adquisición de parámetros. También se comparten herramientas adicionales posteriores a la cuantificación para mejorar el análisis del conjunto de datos de salida de MouseWalker (MW). Finalmente, la utilidad de esta herramienta se demuestra mediante la obtención de valores cuantificables para el rendimiento locomotor general, específicamente los ciclos escalonados y la coordinación extremidad anterior-extremidad posterior, en un contexto de lesión medular (LME).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, el potencial del método MouseWalker se demuestra mediante el análisis del comportamiento locomotor después de LME. Proporciona nuevos conocimientos sobre alteraciones específicas en los patrones de paso, huella y marcha que de otro modo se perderían en otras pruebas estándar. Además de proporcionar una versión actualizada del paquete MW, las herramientas de análisis de datos también se describen utilizando los scripts de Python suministrados (consulte el paso 5).
Como el MW ge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Laura Tucker y Natasa Loncarevic por sus comentarios sobre el manuscrito y el apoyo brindado por el Centro de Roedores del Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Los autores quieren agradecer el apoyo financiero de Prémios Santa Casa Neurociências – Premio Melo e Castro para la Investigación de Lesiones de la Médula Espinal (MC-36/2020) a L.S. y C.S.M. Este trabajo fue apoyado por la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 y UIDP/04462/2020), y LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) a C.S.M. L.S. fue apoyado por un contrato de Investigador Principal Individual de CEEC (2021.02253.CEECIND). A.F.I. fue apoyado por una beca doctoral de FCT (2020.08168.BD). A.M.M. fue apoyado por una beca doctoral de FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. fue apoyado por una beca postdoctoral de FCT (SFRH / BPD / 118051 / 2016). D.N.S. fue apoyado por una beca doctoral de FCT (SFRH / BD / 138636 / 2018).
Materials
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| 12 mm screws | Edmund Optics | M6 | |
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | Blackfly | USB3 | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | ||
| Lens | |||
| Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikkon | 2.8-4D IF | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
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