Denne protokol beskriver krystalliseringsscreening med høj kapacitet, der spænder fra 1,536 mikroassaypladeforberedelse til slutningen af et 6 ugers eksperimentelt tidsvindue. Detaljer er inkluderet om prøveopsætningen, den opnåede billeddannelse, og hvordan brugerne kan udføre analyser ved hjælp af en kunstig intelligens-aktiveret grafisk brugergrænseflade til hurtigt og effektivt at identificere makromolekylære krystalliseringsbetingelser.
Røntgenkrystallografi er den mest almindeligt anvendte teknik til at skelne makromolekylære strukturer, men det afgørende trin i krystallisering af et protein til et ordnet gitter, der kan diffraktioneres, forbliver udfordrende. Krystalliseringen af biomolekyler er stort set eksperimentelt defineret, og denne proces kan være arbejdskrævende og uoverkommelig for forskere ved ressourcebegrænsede institutioner. På National High-Throughput Crystallization (HTX) Center er der implementeret meget reproducerbare metoder til at lette krystalvækst, herunder en automatiseret high-throughput 1.536-brønd mikrobatch-under-oliepladeopsætning designet til at prøve en bred bredde af krystalliseringsparametre. Plader overvåges ved hjælp af state-of-the-art billedbehandlingsmetoder i løbet af 6 uger for at give indsigt i krystalvækst samt for nøjagtigt at skelne værdifulde krystalhits. Desuden strømliner implementeringen af en trænet kunstig intelligens scoringsalgoritme til identifikation af krystalhits kombineret med en open source, brugervenlig grænseflade til visning af eksperimentelle billeder processen med at analysere krystalvækstbilleder. Her beskrives nøgleprocedurer og instrumentering til fremstilling af cocktails og krystalliseringsplader, billeddannelse af pladerne og identifikation af hits på en måde, der sikrer reproducerbarhed og øger sandsynligheden for vellykket krystallisering.
Selv i en tid med enorme fremskridt inden for strukturelle biologiske metoder er røntgenkrystallografi fortsat en pålidelig og populær metode til generering af strukturelle modeller af makromolekyler af høj kvalitet. Over 85% af alle tredimensionelle strukturelle modeller, der er deponeret i Protein Data Bank (PDB), er fra krystalbaserede strukturelle metoder (pr. januar 2023). 1 Desuden er røntgenkrystallografi fortsat uundværlig for at løse protein-ligandstrukturer, en afgørende komponent i lægemiddelopdagelses- og udviklingsprocessen2. På trods af at proteinkrystallisering har været den dominerende strukturelle biologiske teknik i over et halvt århundrede, er metoder til at forudsige krystalliseringssandsynlighed baseret på fysiske egenskaber3 eller sekvens 4,5 stadig i deres barndom.
Forudsigelsen af krystalliseringsbetingelser er endnu mere uklar; Der er gjort begrænsede fremskridt med at forudsige sandsynlige krystalliseringsbetingelser, selv for modelproteiner 6,7. Andre undersøgelser har forsøgt at identificere krystalliseringsbetingelser baseret på proteinhomologi og betingelser udvundet fra PDB 8,9,10. Den forudsigelseskraft, der findes i PDB, er imidlertid begrænset, da kun de endelige, vellykkede krystalliseringsbetingelser er deponeret, hvilket nødvendigvis savner de ofte omfattende optimeringseksperimenter, der kræves for at finjustere krystalvækst. Desuden mangler mange PDB-poster metadata, der indeholder disse detaljer, herunder cocktailformler, krystalliseringsformat, temperatur og tid til at krystallisere11,12. Derfor er den mest tilgængelige måde at bestemme krystallisationsbetingelserne eksperimentelt for mange proteiner af interesse ved hjælp af så mange betingelser som muligt på tværs af en bred vifte af kemiske muligheder.
Flere tilgange til at gøre krystalliseringsscreening så frugtbar og grundig som muligt er blevet undersøgt med stor effekt, herunder sparsomme matricer13, ufuldstændig faktorscreening 14, additiver15,16, såning 17 og nukleeringsmidler 18. National HTX Center ved Hauptman-Woodward Medical Research Institute (HWI) har udviklet en effektiv pipeline til krystalliseringsscreening ved hjælp af mikrobatch-under-olie-tilgangen19, som anvender automatiseret væskehåndtering og billeddannelsesmetoder til at strømline identifikationen af indledende krystalliseringsbetingelser ved hjælp af forholdsvis minimale prøve- og cocktailvolumener (figur 1). Sættet med 1.536 unikke cocktails er baseret på forhold, der tidligere er bestemt til at være befordrende for proteinkrystalvækst og er designet til at være kemisk forskellige for at prøve en lang række mulige krystalliseringsbetingelser20,21,22. Den brede prøveudtagning af krystalliseringsbetingelser øger sandsynligheden for at observere en eller flere krystallisationsledninger.
Få formelle analyser af, hvor mange betingelser der er nødvendige for screening, er dukket op i litteraturen. En undersøgelse fokuserede på prøveudtagningslayoutet af forskellige skærmbilleder og viste, at tilfældig prøveudtagning af komponenter (svarende til en ufuldstændig faktor) repræsenterede den mest grundige og effektive prøveudtagningsmetode23. En anden undersøgelse af screening bemærkede, at der har været adskillige tilfælde, hvor den meget grundige 1.536 skærm kun har givet et enkelt krystal hit24, og en meget nylig undersøgelse fremhævede, at de fleste kommercielle skærme undersampler krystalliseringsrummet, der vides at være forbundet med screening hits25. Ikke alle krystalliseringsledninger vil give en diffraktionskvalitetskrystal, der er egnet til dataindsamling på grund af iboende lidelse i krystallen, diffraktionsbegrænsninger eller krystalfejl; Derfor har støbning af et bredere net for forhold den yderligere fordel at give alternative krystalformer til optimering.
Formatet af proteinkrystalliseringseksperimenter har også indflydelse på skærmens succes. Dampdiffusion er den mest almindeligt anvendte opsætning til krystalliseringsapplikationer med høj kapacitet og bruges på avancerede krystalliseringscentre, herunder EMBL Hamburg og Institut Pasteur screeningscentre med høj kapacitet26,27,28. HTX Center bruger mikrobatch-under-olie-metoden; Selvom det er mindre almindeligt anvendt, er det en robust metode, der minimerer forbruget af prøve- og krystalliseringscocktails20,21,22. En fordel ved mikrobatch-under-olie-metoden, især når der anvendes en paraffinolie med høj viskositet, er, at der kun sker let fordampning inden for dråben under eksperimentet, hvilket betyder, at ligevægtskoncentrationen opnås ved dråbeblanding. Hvis der observeres positive krystallisationsresultater i mikrobatch-under-olie-metoden, er reproduktionen af disse betingelser typisk mere ligetil end i dampdiffusionsopsætninger, hvor krystallisation sker på et udefineret punkt under ligevægten mellem krystallisationsfaldet og reservoiret. Reproducerbarheden af hits er ønskelig for krystalliseringsmetoder med høj kapacitet, som producerer uoverkommeligt små proteinkrystaller, der typisk skal optimeres til enkeltkrystal røntgeneksperimenter.
Krystalliseringsskærmen med høj kapacitet for opløselige proteiner består af cocktails, der tilberedes internt, færdige kommercielle skærme og internt modificerede kommercielle skærme22. Cocktailsene blev oprindeligt udviklet ved hjælp af den ufuldstændige faktorstrategi ved hjælp af tidligere vellykkede krystalliseringscocktails20. Reagenserne i skærmen, der er kommercielt tilgængelige, omfatter arrays af polymerer, krystallisationssalte, PEG og ionkombinationer og skærme, der anvender sparsom matrix og ufuldstændige faktorielle tilgange. Der er også reagenser, der modificeres før optagelse i skærmen: en additiv skærm, en pH- og bufferskærm, en ionisk flydende additivskærm og en polymerskærm.
Kraften i kendte krystalliseringsbetingelser og strategier er blevet udnyttet i de 1.536 krystalliseringscocktails sammen med fordelene ved mikrobatch-under-olie-systemet til at generere en rørledning, der anvender automatiseret væskehåndtering, automatiseret brightfield-billeddannelse og anden ordens ikke-lineær billeddannelse af chirale krystaller (SONICC). Automatiseringen af både væskehåndtering og billeddannelse giver fordelene ved færre våde laboratorietimer og højere reproducerbarhed. Den automatiserede krystalliseringsscreenings høje kapacitet nødvendiggør automatisering af processen med overvågning af krystalvækst. Disse fremskridt opnås med state-of-the-art billeddannelsesteknologier til at hjælpe med at identificere positive krystalhits. Både standard brightfield-billeddannelse af plader såvel som multifotonmetoder til forbedret detektion anvendes via et krystalbilleddannelsessystem med SONICC (figur 2). SONICC kombinerer anden harmonisk generation (SHG)29 mikroskopi og ultraviolet to-foton exciteret fluorescens (UV-TPEF)30 mikroskopi for at detektere meget små krystaller, såvel som dem, der er skjult af bundfald. SONIC-billeddannelsen informerer om, hvorvidt brøndene indeholder protein (via UV-TPEF) og krystaller (via SHG). Ud over den positive identifikation af proteinkrystaller kan yderligere oplysninger også opnås ved hjælp af state-of-the-art billeddannelsesmetoder. Billeddannelse kun med cocktails før tilsætning af prøver fungerer som en negativ kontrol; Disse billeder kan identificere brøndens udseende inden tilsætning af prøver, herunder med hensyn til saltkrystaller og snavs. Derudover hjælper SHG- og UV-TPEF-billeddannelse med at differentiere proteinkrystaller fra saltkrystaller og kan bruges til visualisering af proteinnukleinsyrekomplekst materiale31.
Krystalliseringseksperimenter med høj kapacitet, der gennemgår gentagen overvågning via billeddannelse, resulterer i en meget stor mængde billeder, der skal undersøges. Automatiserede krystalscoringsmetoder er blevet udviklet for at reducere byrden for brugeren og øge sandsynligheden for at identificere positive krystalhits. HTX Center deltog i udviklingen af MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO) scoringsalgoritme, en trænet dyb convolutional neural netværksarkitektur udviklet af et konsortium af akademiske, non-profit, offentlige og industrielle partnere til at klassificere brightfield brøndbilleder32. Algoritmen blev trænet på næsten en halv million brightfield-billeder fra krystalliseringseksperimenter fra flere institutioner ved hjælp af forskellige krystalliseringsmetoder og forskellige billeddannere. Algoritmen udsender en sandsynlighedsscore, der angiver, om et givet billede falder i fire mulige billedklasser: “krystal”, “klar”, “bundfald” og “andet”. MARCO har en rapporteret klassificeringsnøjagtighed på 94,5%. Krystaldetektion forbedres yderligere med software, der implementerer algoritmen og giver en grafisk brugergrænseflade (GUI) til tilgængelig og enkel billedvisning, aktiveret med de AI-aktiverede scoringsfunktioner32,33. MARCO Polo GUI er designet til at fungere problemfrit med opsætningen af billedbehandlings- og datastyringssystemet i HTX Center for at identificere hits i skærmen med 1.536 brønde med menneskelig engagement for at undersøge outputtet af sorterede lister. Derudover er GUI’en som open source-software, der er tilgængelig på GitHub, let tilgængelig til ændring for at afspejle de specifikke behov hos andre laboratoriegrupper.
Her beskrives processen med at etablere et high-throughput microbatch-under-oil eksperiment ved hjælp af robotvæskehåndtering til at levere både cocktail og protein. HTX Center har et unikt udvalg af instrumenter og ressourcer, der ikke findes på andre institutioner, med det formål at levere screeningstjenester og uddannelsesressourcer til interesserede brugere. Demonstration af metoder og evner i robotik-aktiverede high-throughput teknikker vil gøre det muligt for samfundet at have viden om tilgængelige teknologier og træffe beslutninger for deres egen strukturbestemmelsesindsats.
Metoden beskriver en high-throughput pipeline til proteinkrystalliseringsscreening, der kræver så lidt som 500 μL prøve til 1.536 individuelle krystallisationseksperimenter i mikrobatch-under-olie-formatet. Rørledningen er afhængig af væskehåndteringsrobotik til hurtigt og reproducerbart at hjælpe den eksperimentelle opsætning samt den beregningsmæssige billedanalyseressource MARCO Polo, som er tilpasset til at analysere 1.536-brønds pladebilleder ved hjælp af MARCO-algoritmen til at identificere og isolere krystalhits.
Den lille mængde individuelle screeningsdråber (400 nL i alt med et forhold på 1: 1 prøve: cocktail) betyder, at der kræves ekstremt små prøvevolumener for at identificere positive krystalliseringsbetingelser. Disse små dråbestørrelser producerer nødvendigvis små krystaller, der ikke kan fiskes ved traditionel looping. Der er udviklet metoder til høst fra de 1.536 plader37; Derudover er pladerne med krystaller blevet brugt direkte ved synkrotronkilder til in situ dataindsamling38. Hvis der blev udviklet en robust metode til høst af disse krystaller, ville fremskridt inden for synkrotronteknologi og mikrofokuserede stråler yderligere gøre det muligt at opnå nyttige datasæt. Derudover kunne de opnåede krystaller potentielt bruges som frø til optimeringsindsats.
SONICC billeddannelse er klart fordelagtigt til at identificere både små proteinkrystaller og proteinkrystaller skjult under bundfald. På trods af disse fordele er ikke alle prøvetyper modtagelige for SHG- og UV-TPEF-billeddannelse. For eksempel vil proteiner med få eller ingen aromatiske tryptophanrester vise et tvetydigt UV-TPEF-signal. Desuden vil krystaller i specifikke rumgrupper, herunder centrosymmetriske grupper eller punktgruppe 432, ikke blive opdaget af SHG-billeddannelse. Prøver med fluoroforer interfererer undertiden med SHG-signalet, hvilket resulterer i annullering af signalet eller øget intensitet, hvilket betyder, at omhyggelig fortolkning af SHG-signaler er påkrævet for metalholdige proteiner og proteiner, der indeholder fluorescerende dele. I mange tilfælde er det imidlertid muligt at rationalisere fraværet af et SHG- eller UV-TPEF-signal, og manglen på disse signaler bør ikke nødvendigvis udelukke tilstedeværelsen af en proteinkrystal.
Mikrobatch-under-olie-formatet giver et alternativ til den mere almindelige dampdiffusionsmetode, der anvendes til krystallografi med høj kapacitet. Det er vigtigt, at krystalliseringsformatets indvirkning rammer identifikation39, hvilket giver en begrundelse for brugen af forskellige krystalliseringsformater til screeningsindsats med høj kapacitet. Automatiseret billeddannelse og SONICC-aktiverede modaliteter hjælper med hurtig identifikation af proteinkrystaller gennem hele det 6 ugers eksperimentelle tidsforløb. Endelig giver MARCO Polo GUI brugerne mulighed for hurtigt at analysere billeder fra 1.536 forhold for at identificere lovende hitbrønde til optimering. Funktionerne på HTX Center, herunder den robotik-aktiverede eksperimentelle opsætning med høj kapacitet, kombineret med de nyeste billeddannelses- og beregningsværktøjer til analyser, yder et stort bidrag til det strukturelle biologiske samfund ved at give forskere mulighed for effektivt at tackle en primær flaskehals i krystalbaseret strukturelt arbejde: at finde krystalliseringsbetingelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne udtrykke vores taknemmelighed over for vores brugere for at have betroet deres dyrebare prøver til os til krystalscreening, samt for at give kritisk feedback og anmodninger, der har hjulpet os med at forfine og udvikle vores ressourcer til bedre at tjene det strukturelle biologiske samfund. Vi vil også gerne takke Ethan Holleman, Dr. Lisa J Keefe og Dr. Erica Duguid, som drev udviklingen af MARCO Polo GUI. Vi vil gerne takke HWI-kollegerne for deres støtte og forslag, især Dr. Diana CF Monteiro. Vi anerkender økonomisk støtte fra National Institutes of Health, R24GM141256.
1536 Well Imp@ct LBR LoBase | Greiner Bio-One | 790 801 | |
Acetic acid | Hampton Research | HR2-853 | |
AlumaSeal II Sealing Film | Hampton Research | HR8-069 | |
Ammonium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-247 | |
Ammonium chloride | Hampton Research | HR2-691 | |
Ammonium hydroxide | Hampton Research | HR2-855 | |
Ammonium nitrate | Hampton Research | HR2-665 | |
Ammonium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-629 | |
Ammonium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-555 | |
Ammonium sulfate | Hampton Research | HR2-541 | |
Ammonium thiocyanate | Molecular Dimensions | MD2-100-301 | |
Bicine pH 9.0 | Hampton Research | HR2-723 | |
Bis-tris propane pH 7.0 | Hampton Research | HR2-993-08 | |
Calcium acetate | Hampton Research | HR2-567 | |
Calcium chloride dihydrate | Hampton Research | HR2-557 | |
CAPS pH 10.0 | Rigaku Reagents | none given | |
ClearSeal Film | Hampton Research | HR4-521 | |
Cobalt sulfate heptahydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-42 | |
Crystal Screen HT screen | Hampton Research | HR2-130 | |
Formulator | Formulatrix | ||
Glycerol | Hampton Research | HR2-623 | |
Gryphon liquid handling robot | Art Robbins Instruments | ||
HEPES pH 7.0 | Hampton Research | HR2-902-03 | |
HEPES pH 7.5 | Hampton Research | HR2-902-08 | |
HWI HTX Center sample submission form | https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/ | ||
Hydrochloric acid | Hampton Research | HR2-581 | |
Index HT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
Ionic Liquid screen | Hampton Research | HR2-214 | |
Lithium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-312 | |
Lithium chloride | Hampton Research | HR2-631 | |
Lithium sulfate monohydrate | Hampton Research | HR2-545 | |
Magnesium acetate tetrahydrate | Hampton Research | HR2-561 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Hampton Research | HR2-559 | |
Magnesium nitrate hexahydrate | Hampton Research | HR2-657 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Hampton Research | HR2-821 | |
Manganese chloride tetrahydrate | Millipore Sigma | 63535-50G | |
Manganese sulfate monohydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-310 | |
MARCO Polo GUI download | https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/ | ||
Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot | Thermo Scientific | ||
MES pH 6.0 | Hampton Research | HR2-943-09 | |
Mosquito liquid handling robot | SPTLabtech | ||
Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F | Sigma Aldrich | PX0045-3 | |
PEG 1000 | Hampton Research | HR2-523 | |
PEG 2000 | Hampton Research | HR2-592 | |
PEG 20000 | Hampton Research | HR2-609 | |
PEG 3350 | Hampton Research | HR2-527 | |
PEG 400 | Hampton Research | HR2-603 | |
PEG 4000 | Hampton Research | HR2-529 | |
PEG 6000 | Hampton Research | HR2-533 | |
PEG 8000 | Hampton Research | HR2-535 | |
PEG/Ion HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
PEGRx HT screen | Hampton Research | HR2-086 | |
Plate reservations | htslab@hwi.buffalo.edu | ||
Potassium acetate | Hampton Research | HR2-671 | |
Potassium bromide | Hampton Research | HR2-779 | |
Potassium carbonate | Molecular Dimensions | MD2-100-311 | |
Potassium chloride | Hampton Research | HR2-649 | |
Potassium nitrate | Hampton Research | HR2-663 | |
Potassium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-635 | |
Potassium phosphate-monobasic | Hampton Research | HR2-553 | |
Potassium phosphate-tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-309 | |
Potassium thiocyanate | Hampton Research | HR2-695 | |
Rock Imager 1000 with SONICC | Formulatrix | ||
Rock Imager 54 | Formulatrix | ||
Rubidium chloride | Millipore Sigma | R2252-10G | |
SaltRx HT screen | Hampton Research | HR2-136 | |
Silver Bullets screen | Hampton Research | HR2-096 | |
Slice pH screen | Hampton Research | HR2-070 | |
Sodium acetate pH 5.0 | Hampton Research | HR2-933-15 | |
Sodium bromide | Hampton Research | HR2-699 | |
Sodium chloride | Hampton Research | HR2-637 | |
Sodium citrate pH 4.2 | Hampton Research | HR2-935-01 | |
Sodium citrate pH 5.6 | Hampton Research | HR2-735 | |
Sodium hydroxide | Hampton Research | HR2-583 | |
Sodium molybdate dihydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-207 | |
Sodium nitrate | Hampton Research | HR2-661 | |
Sodium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-551 | |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Molecular Dimensions | MD-100-307 | |
StockOptions Polymer screen | Hampton Research | HR2-227 | |
Tacsimate pH 7 | Hampton Research | HR2-755 | |
TAPS pH 9.0 | bioWORLD | 40121071 | |
Tris pH 8 | Hampton Research | HR2-900-11 | |
Tris pH 8.5 | Hampton Research | HR2-725 | |
ViaFLO 384 | Integra | ||
ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL) | Integra | ||
ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL) | Integra | ||
Zinc acetate dihydrate | Hampton Research | HR2-563 |