High-throughput screening om kristalhits te verkrijgen voor eiwitkristallografie

Summary

Dit protocol beschrijft high-throughput kristallisatiescreening, variërend van de 1.536 microassay-plaatvoorbereiding tot het einde van een experimenteel tijdvenster van 6 weken. Details zijn opgenomen over de monsteropstelling, de verkregen beeldvorming en hoe gebruikers analyses kunnen uitvoeren met behulp van een grafische gebruikersinterface met kunstmatige intelligentie om macromoleculaire kristallisatieomstandigheden snel en efficiënt te identificeren.

Abstract

Röntgenkristallografie is de meest gebruikte techniek om macromoleculaire structuren te onderscheiden, maar de cruciale stap van het kristalliseren van een eiwit in een geordend rooster dat vatbaar is voor diffractie blijft een uitdaging. De kristallisatie van biomoleculen is grotendeels experimenteel gedefinieerd en dit proces kan arbeidsintensief en onbetaalbaar zijn voor onderzoekers van instellingen met beperkte middelen. In het National High-Throughput Crystallization (HTX) Center zijn zeer reproduceerbare methoden geïmplementeerd om kristalgroei te vergemakkelijken, waaronder een geautomatiseerde high-throughput 1.536-well microbatch-under-oil plate-opstelling die is ontworpen om een breed scala aan kristallisatieparameters te bemonsteren. Platen worden gemonitord met behulp van state-of-the-art beeldvormingsmodaliteiten in de loop van 6 weken om inzicht te geven in kristalgroei en om waardevolle kristaltreffers nauwkeurig te onderscheiden. Bovendien stroomlijnt de implementatie van een getraind scorealgoritme voor kunstmatige intelligentie voor het identificeren van kristaltreffers, in combinatie met een open-source, gebruiksvriendelijke interface voor het bekijken van experimentele afbeeldingen, het proces van het analyseren van kristalgroeibeelden. Hier worden de belangrijkste procedures en instrumentatie beschreven voor de bereiding van de cocktails en kristallisatieplaten, het in beeld brengen van de platen en het identificeren van treffers op een manier die reproduceerbaarheid garandeert en de kans op succesvolle kristallisatie verhoogt.

Introduction

Zelfs in een tijdperk van enorme vooruitgang in structurele biologische methoden, blijft röntgenkristallografie een betrouwbare en populaire methode voor het genereren van hoogwaardige structurele modellen van macromoleculen. Meer dan 85% van alle driedimensionale structurele modellen die zijn gedeponeerd bij de Protein Data Bank (PDB) zijn afkomstig van op kristal gebaseerde structurele methoden (vanaf januari 2023). ¹ Bovendien blijft röntgenkristallografie onmisbaar voor het oplossen van eiwit-ligandstructuren, een cruciaal onderdeel van het ontdekkings- en ontwikkelingsproces van geneesmiddelen². Ondanks dat eiwitkristallisatie al meer dan een halve eeuw de dominante structuurbiologische techniek is gebleven, staan methoden om kristallisatiekans te voorspellen op basis van fysische eigenschappen³ of sequentie ^4,5 nog in de kinderschoenen.

De voorspelling van kristallisatiecondities is nog duisterder; Er is beperkte vooruitgang geboekt om waarschijnlijke kristallisatieomstandigheden te voorspellen, zelfs voor modeleiwitten ^6,7. Andere studies hebben geprobeerd kristallisatiecondities te identificeren op basis van eiwit homologie en aandoeningen gedolven uit de PDB 8,9,10. De voorspellende kracht die in de VOB te vinden is, is echter beperkt, omdat alleen de uiteindelijke, succesvolle kristallisatiecondities worden afgezet, die noodgedwongen de vaak uitgebreide optimalisatie-experimenten missen die nodig zijn om de kristalgroei te verfijnen. Verder missen veel PDB-vermeldingen metadata die deze details bevatten, waaronder de cocktailformules, kristallisatieformaat, temperatuur en tijd om^11,12 te kristalliseren. Daarom is voor veel eiwitten van belang de meest toegankelijke manier om de kristallisatiecondities te bepalen experimenteel, waarbij zoveel mogelijk voorwaarden worden gebruikt voor een breed scala aan chemische mogelijkheden.

Verschillende benaderingen om kristallisatiescreening zo vruchtbaar en grondig mogelijk te maken, zijn met groot effect onderzocht, waaronder schaarse matrices 13, onvolledige factoriële screening 14, additieven 15,16^, zaaien 17 en nucleating agents ¹⁸. Het National HTX Center van het Hauptman-Woodward Medical Research Institute (HWI) heeft een efficiënte pijplijn ontwikkeld voor kristallisatiescreening met behulp van de microbatch-under-oil-benadering¹⁹, die gebruik maakt van geautomatiseerde vloeistofbehandeling en beeldvormingsmodaliteiten om de identificatie van initiële kristallisatiecondities te stroomlijnen met behulp van relatief minimale monster- en cocktailvolumes (figuur 1). De set van 1.536 unieke cocktails is gebaseerd op omstandigheden waarvan eerder is vastgesteld dat ze bevorderlijk zijn voor de groei van eiwitkristallen en zijn ontworpen om chemisch divers te zijn om een groot aantal mogelijke kristallisatiecondities te bemonsteren^20,21,22. De brede bemonstering van kristallisatiecondities verhoogt de kans op het waarnemen van een of meer kristallisatiekabels.

In de literatuur zijn weinig formele analyses verschenen van hoeveel voorwaarden nodig zijn voor screening. Eén studie richtte zich op de steekproeflay-out van verschillende schermen en ontdekte dat de willekeurige bemonstering van componenten (vergelijkbaar met een onvolledige factoriaal) de meest grondige en efficiënte steekproefmethode vertegenwoordigde²³. Een andere studie van screening merkte op dat er talloze gevallen zijn geweest waarin het zeer grondige 1.536-scherm slechts een enkele kristalhit²⁴ heeft opgeleverd, en een zeer recente studie benadrukte dat de meeste commerciële schermen de kristallisatieruimte waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met screening hits²⁵ ondersamplen. Niet alle kristallisatiekabels zullen een kristal van diffractiekwaliteit opleveren dat geschikt is voor gegevensverzameling vanwege inherente wanorde in het kristal, diffractiebeperkingen of kristalfouten; Daarom heeft het werpen van een breder net voor omstandigheden het extra voordeel dat het alternatieve kristalvormen biedt voor optimalisatie.

Het formaat van eiwitkristallisatie-experimenten heeft ook invloed op het succes van het scherm. Dampdiffusie is de meest gebruikte opstelling voor high-throughput kristallisatietoepassingen en wordt gebruikt in state-of-the-art kristallisatiecentra, waaronder de EMBL Hamburg en Institut Pasteur high-throughput screening centers^26,27,28. Het HTX Center maakt gebruik van de microbatch-under-oil methode; Hoewel het minder vaak wordt gebruikt, is het een robuuste methode die het verbruik van monster- en kristallisatiecocktails minimaliseert^20,21,22. Een voordeel van de microbatch-onder-olie-methode, met name bij gebruik van een paraffineolie met hoge viscositeit, is dat er tijdens het experiment slechts lichte verdamping optreedt binnen de druppel, wat betekent dat de evenwichtsconcentratie wordt bereikt bij het mengen van druppels. Als positieve kristallisatieresultaten worden waargenomen in de microbatch-onder-oliemethode, is de reproductie van deze omstandigheden meestal eenvoudiger dan in dampdiffusie-opstellingen, waarbij kristallisatie plaatsvindt op een ongedefinieerd punt tijdens de evenwichtsbalans tussen de kristallisatiedruppel en het reservoir. De reproduceerbaarheid van hits is wenselijk voor high-throughput kristallisatiebenaderingen, die onbetaalbaar kleine eiwitkristallen produceren die meestal moeten worden geoptimaliseerd voor röntgenexperimenten met één kristal.

Het high-throughput kristallisatiescherm voor oplosbare eiwitten bestaat uit cocktails die in eigen huis worden bereid, kant-en-klare commerciële schermen en in-house aangepaste commerciële schermen²². De cocktails werden in eerste instantie ontwikkeld met behulp van de onvolledige factoriële strategie met behulp van eerder succesvolle kristallisatiecocktails²⁰. De reagentia in het scherm die in de handel verkrijgbaar zijn, omvatten arrays van polymeren, kristallisatiezouten, PEG en ionencombinaties en schermen die gebruikmaken van schaarse matrix en onvolledige factoriële benaderingen. Er zijn ook reagentia die worden aangepast voordat ze in het scherm worden opgenomen: een additiefscherm, een pH- en bufferscherm, een ionische vloeibare additievenzeef en een polymeerzeef.

De kracht van bekende kristallisatiecondities en -strategieën is benut in de 1.536 kristallisatiecocktails, samen met de voordelen van het microbatch-onder-oliesysteem om een pijplijn te genereren die gebruik maakt van geautomatiseerde vloeistofverwerking, geautomatiseerde brightfield-beeldvorming en tweede orde niet-lineaire beeldvorming van chirale kristallen (SONICC). De automatisering van zowel de vloeistofbehandeling als de beeldvorming biedt de voordelen van minder natte laboratoriumuren en een hogere reproduceerbaarheid. De high-throughput aard van geautomatiseerde kristallisatie screening vereist de automatisering van het proces van monitoring voor kristalgroei. Deze vooruitgang wordt bereikt met state-of-the-art beeldvormingstechnologieën om te helpen bij de identificatie van positieve kristaltreffers. Zowel standaard brightfield imaging van platen, als multi-foton methoden voor verbeterde detectie, worden gebruikt via een kristalbeeldvormingssysteem met SONICC (figuur 2). SONICC combineert tweede harmonische generatie (SHG)²⁹ microscopie en ultraviolette twee-foton geëxciteerde fluorescentie (UV-TPEF)³⁰ microscopie om zeer kleine kristallen te detecteren, evenals die verduisterd door neerslag. De SONICC-beeldvorming informeert of de putten eiwitten (via UV-TPEF) en kristallen (via SHG) bevatten. Naast de positieve identificatie van eiwitkristallen, kan ook aanvullende informatie worden verkregen met behulp van state-of-the-art beeldvormingsmethoden. Cocktail-only beeldvorming voorafgaand aan toevoeging van het monster dient als een negatieve controle; Deze afbeeldingen kunnen het uiterlijk van de put identificeren voorafgaand aan de toevoeging van het monster, inclusief in termen van zoutkristallen en puin. Bovendien helpen SHG- en UV-TPEF-beeldvorming bij het onderscheiden van eiwitkristallen van zoutkristallen en kunnen ze worden gebruikt voor het visualiseren van eiwit-nucleïnezuurcomplexmateriaal³¹.

High-throughput kristallisatie-experimenten die herhaaldelijk worden gecontroleerd via beeldvorming resulteren in een zeer groot aantal beelden dat moet worden onderzocht. Geautomatiseerde kristalscoremethoden zijn ontwikkeld om de belasting voor de gebruiker te verminderen en de kans op het identificeren van positieve kristaltreffers te vergroten. Het HTX Center nam deel aan de ontwikkeling van het MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO) scoringsalgoritme, een getrainde diepe convolutionele neurale netwerkarchitectuur ontwikkeld door een consortium van academische, non-profit, overheids- en industriële partners om brightfield-putbeelden te classificeren³². Het algoritme werd getraind op bijna een half miljoen brightfield-beelden van kristallisatie-experimenten van meerdere instellingen met behulp van verschillende kristallisatiemethoden en verschillende imagers. Het algoritme geeft een probabilistische score weer die aangeeft of een bepaald beeld in vier mogelijke beeldklassen valt: “kristal”, “helder”, “neerslag” en “overig”. MARCO heeft een gerapporteerde classificatienauwkeurigheid van 94,5%. Kristaldetectie is verder verbeterd met software die het algoritme implementeert en een grafische gebruikersinterface (GUI) biedt voor toegankelijke en eenvoudige beeldweergave, mogelijk gemaakt met de AI-enabled scoringsmogelijkheden^32,33. De MARCO Polo GUI is ontworpen om naadloos samen te werken met de installatie van het beeldvormings- en gegevensbeheersysteem in het HTX Center om hits in het 1.536-well-scherm te identificeren, met menselijke betrokkenheid om de uitvoer van gesorteerde lijsten te onderzoeken. Bovendien, als open-source software beschikbaar op GitHub, is de GUI direct beschikbaar voor aanpassing aan de specifieke behoeften van andere laboratoriumgroepen.

Hier wordt het proces beschreven van het opzetten van een high-throughput microbatch-under-oil-experiment met behulp van robotische vloeistofbehandeling om zowel de cocktail als het eiwit af te leveren. Het HTX Center heeft een unieke reeks instrumenten en bronnen die niet bij andere instellingen te vinden zijn, met als doel screeningdiensten en educatieve middelen te bieden aan geïnteresseerde gebruikers. Het demonstreren van de methoden en mogelijkheden van robotica-enabled high-throughput technieken zal de gemeenschap in staat stellen om kennis te hebben van beschikbare technologieën en beslissingen te nemen voor hun eigen structuurbepalingsinspanningen.

Protocol

1. Bereiding of aankoop van cocktails voor zestien 96-well deep well blocks Bereid in-house gegenereerde chemische cocktails door te doseren in 96-well deep well (DW) blokken. Gebruik een robotische vloeistofhandler om voorraadoplossingen van zouten, buffers, polymeren en water af te geven en te mengen. Bereid in-house gemodificeerde chemische cocktails voor met behulp van een robotische vloeistofhandler of meerkanaalspipet om extra componenten toe te voegen aan DW-blokschermen met 96 putten die commercieel zijn gekocht. Koop in de handel verkrijgbare DW-blokken. Bewaar gelabelde DW-blokken met 96 putten bij −20 °C gedurende 12-18 maanden.OPMERKING: De cocktails bereid in stap 1.1. en 1.2. vul 10/16 96-well DW-blokken en 5/16 96-well DW-blokken worden gebruikt zoals gekocht. Eén DW-blok met 96 putten in het scherm wordt ingesteld op het moment van de afgifte van de 1.536-putplaat om neerslag van het additievenscherm te voorkomen (zie rubriek 3). 2. Doseer de cocktails op borden met 384 putten Ontdooi de 96-well DW-blokken ‘s nachts bij 4 °C. Breng op kamertemperatuur (20-23 °C) voordat u begint met de bereiding van de 384-putplaten.OPMERKING: Kamertemperatuur is geschikt voor het bereiden van de cocktailborden. De belangrijkste zorg bij het bereiden van deze platen is om neerslag te voorkomen, die vloeistofbehandelingsapparaten kunnen verstoppen en kunnen leiden tot onvoorspelbare veranderingen in de concentraties van de cocktailingrediënten. Meng de blokken grondig door inversie als dat nodig is om een hardnekkig ondoorzichtig neerslag op te lossen. Als putten neerslag bevatten, verwarm de blokken dan tot 30 °C om op te lossen. Lever 50 μL cocktailoplossing van vier DW-blokken met 96 putten op één plaat met 384 putten met behulp van een vloeistofbehandelingsrobot die is uitgerust met een 96-spuit of pipettorkop. De vier DW-blokken met 96 putten worden zodanig in de 384-putplaat gestempeld dat kwadranten worden gevuld (bijv. A1 van 96-DW1 tot A1 van 384-plaat1, A1 van 96-DW2 tot B1 van 384-plaat1, enz.) (Figuur 3). Lever 15 van de 16 DW-blokken met 96 putten aan 384-putplaten voor opslag. Bewaar de 384-putplaten bij −20 °C gedurende maximaal 6 maanden voor gebruik bij het bereiden van de 1.536-putplaten. 3. Het bereiden van de 1.536-well platen met olie en kristallisatie cocktails Lever 5 μL paraffineolie aan elke put van een plaat met 1.536 putten met behulp van een robotisch vloeistofbehandelingssysteem met de capaciteit voor langzame aspiratie en levering. Bewaar de olieplaten bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden. Ontdooi de 384-putplaten uit vak 2 bij 4 °C een nacht. Keer de platen om om de oplossingen te mengen en los het neerslag op. Incubeer de platen bij 30 °C om hardnekkige neerslag op te lossen. Om de additieve zeefcomponenten voor te bereiden, gebruikt u het laatste DW-blok met 96 putten met 0,1 M HEPES pH 6,8, 30% PEG3350 om te mengen met het commerciële additievenscherm met behulp van een vloeistofbehandelingsrobot of een meerkanaalspipet. Bereid de additieve zeefoplossingen door een 1:1 mengsel van de in stap 3.3 bereide gebufferde PEG3350-oplossing en het additievenzeef te doseren tot een eindvolume van 50 μL in de juiste plaat met 384 putten. Gebruik een vloeistofbehandelingsrobot uitgerust met een 384-spuit of pipettorkop om 200 nL cocktailoplossing in elk putje van de 1.536-putplaat af te leveren. Stamp vier 384-putplaten uit in de 1.536-putplaat, zodat kwadranten worden gevuld (bijv. A1 van 384-plaat1 tot A1 van de 1.536-putplaat, A2 van 384-plaat1 tot A3 van de 1.536-putplaat, enz.) (Figuur 3). Centrifugeer de platen gedurende 5 minuten op 150 × g voordat ze gedurende maximaal 4 weken bij 4 °C worden bewaard. 4. Voorbeeld inzending Als u een voorbeeld wilt indienen, stuurt u een reserveringsmail vóór de reserveringsdeadline voor de komende vertoningsrun. Vermeld het aantal screeningsexperimenten, de naam, de PI en de instelling, evenals eventuele speciale behandelingsvereisten voor het monster. Screeningsruns worden ongeveer één keer per maand uitgevoerd, wat resulteert in 12 runs per jaar. Vul een formulier voor het indienen van een voorbeeld in voordat u het monster verzendt.Kies voor nieuwe gebruikers een wachtwoord dat wordt gebruikt om de kristallisatiebeelden in sectie 7 te downloaden. Gebruik voor gevestigde gebruikers een bestaand wachtwoord of wijzig het wachtwoord bij deze stap. Breng het monster in een buis van 1,5 ml. Zorg ervoor dat het macromolecuul homogeen en voldoende geconcentreerd is om kristallisatie te bevorderen. Gebruik een prekristallisatietest, meestal samengesteld uit ammoniumsulfaat of PEG 4.000, om de juiste monsterconcentratie te onderzoeken door te observeren of de geteste monsterconcentraties resulteren in heldere druppels of neerslag34.OPMERKING: Geschikte kwaliteitstests die voorafgaand aan het indienen van het monster kunnen worden uitgevoerd om te controleren op zuiverheid en homogeniteit zijn onder andere SDS-PAGE, gelfiltratie en dynamische lichtverstrooiing (DLS). Kristallisatie kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van zelfs kleine onzuiverheden. Een monstervolume van 500 μL is momenteel vereist om één plaat met 1.536 putten op te zetten. Er worden tests uitgevoerd om de vereiste monstervolumes te verminderen.Vermijd het gebruik van bufferconcentraties groter dan 50 mM, evenals fosfaten, die in het scherm kunnen kristalliseren. Vermijd overmatige oplosmiddelen, waaronder glycerolconcentraties hoger dan 10% w / v. Verpak het monster om veilig een geschikte temperatuur te handhaven met behulp van droogijs, nat ijs of koelverpakkingen in een verzegelde container. Verzend monsterprioriteit ‘s nachts op een maandag-woensdag tijdens de run. E-mail het trackingnummer zodra het monster is verzonden. 5. Monsteropstelling in de voorbereide 1.536-putplaten Pak monsters uit en incuber onmiddellijk bij de temperatuur die de gebruiker heeft aangevraagd. Eenmaal ontdooid, centrifugeer het monster gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur bij 10.000 × g . Observeer het monster visueel om neerslag, kleur en conditie van het monster te identificeren voordat het wordt ingesteld. Verwarm de plaat met 1.536 putten tot 23 °C en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 150 × g . Stel de cocktailplaat voor met behulp van brightfield-beeldvorming als een negatieve controle.OPMERKING: Alle platen worden afgebeeld met brightfield-beeldvorming voorafgaand aan het instellen van het monster, waardoor de identificatie van putten die al kristallen of puin bevatten mogelijk is voordat het monster wordt toegevoegd als een negatieve controle. Verder maakt het de identificatie mogelijk van putten waarin de kristallisatiecocktail niet is afgeleverd. Het opwarmen van de plaat tot kamertemperatuur elimineert condensatie op het plaatoppervlak, wat leidt tot duidelijke beelden. Doseer 200 nL monster aan elke put in de 1.536-putplaat met behulp van een vloeistofbehandelingsrobot. Centrifugeplaat bij 150 × g en incubatieplaten bij 4 °C, 14 °C of 23 °C.OPMERKING: Microbatch onder-olie-experimenten kunnen met de hand worden opgezet door het eiwit en de cocktail onder de gewenste olie te doseren. Het wordt echter aanbevolen om niet minder dan 1 μL van elk eiwit en elke cocktail te gebruiken om reproduceerbare resultaten te bereiken. 6. Controleer 1.536-putplaten op kristalvorming Nadat het monster is toegevoegd aan de 1.536-putplaten, beeld met brightfield-beeldvorming op dag 1 en week 1, week 2, week 3, week 4 en week 6. Voer SONICC-beeldvorming uit met SHG en UV-TPEF op het tijdstip van 4 weken voor platen die worden geïncubeerd bij 23 °C en op het tijdstip van 6 weken voor platen die worden geïncubeerd bij 14 °C of 4 °C.OPMERKING: De timing voor de SONICC-beeldvorming is gepland op de tijdstippen van 4 weken en 6 weken voor de 1.536 microassayplaat met hoge doorvoer, omdat kristallen meestal op die tijdstippen verschijnen. Voor modificatie naar een 96-well microbatch onder olie- of dampdiffusie-experimenten, is het raadzaam om de SONICC-beeldvorming eerder in het tijdvenster uit te voeren. Krijg toegang tot de experimentele beelden die automatisch zijn overgebracht naar het gebruikersaccount met behulp van een intern LIMS-systeem. Informeer de gebruikers via een geautomatiseerde htslab e-mail daemon dat imaging heeft plaatsgevonden. 7. Beeldanalyse Haal de screeningsbeelden op van de HWI ftp-site voor elk .rar bestand.OPMERKING: De beelduitvoer van het 1.536-scherm resulteert in een aantal bestanden met brightfield-afbeeldingen, SHG-afbeeldingen en UV-TPEF-afbeeldingen. Elke beeldvormingsmodaliteit of elk tijdstip is een afzonderlijk .rar bestand. Elk .rar bestand bevat, wanneer het wordt uitgepakt, een afbeelding van elke put van de 1.536-putplaat op een specifiek tijdstip met behulp van een specifieke beeldvormingsmodaliteit.Gebruik de FileZilla Client of andere opties om toegang te krijgen tot de ftp-gegevens.OPMERKING: De FileZilla Client is de aanbevolen manier om het grote bestandsoverdrachtvolume te beheren om computercrashes te minimaliseren.Als FileZilla Client op de computer van de gebruiker moet worden geïnstalleerd, downloadt u de FileZilla-software. Als FileZilla Client al is geïnstalleerd of bij installatie, klikt u op het FileZilla-pictogram om de software te openen. Meld u aan bij de externe ftp-server van FileZilla door de hostftp-website, gebruikersnaam en wachtwoord in te voeren. Download de .rar bestanden naar de gewenste map. Gebruik de ai-enabled open-source GUI om de kristallisatiebeelden te bekijken, te scoren en te analyseren.OPMERKING: De GUI kan worden gebruikt op de meeste Windows-, Mac- en Linux-besturingssystemen (OS) en OS-specifieke instructies voor het downloaden bevinden zich op de GitHub-site. MARCO Polo is een open-source GUI die metadata bevat van het high-throughput 1.536 kristallisatiescherm dat is geïmplementeerd in het HTX Center. Het is voor iedereen beschikbaar om te downloaden van GitHub voor aanpassing aan de specifieke behoeften van andere laboratoriumgroepen.Open het .rar bestand in de GUI nadat het bestand is gedownload (zie aanvullende afbeelding S1).Klik op Importeren, selecteer Afbeeldingen in het vervolgkeuzemenu en selecteer vervolgens Uit Rar-archief / directory. Klik op Bladeren naar map in het pop-upvenster en navigeer vervolgens naar de map met de afbeeldingen. Selecteer de gewenste bestanden en importeer deze in de GUI door op Openen te klikken. Wacht tot de bestanden worden weergegeven in het venster Geselecteerde paden . Selecteer een of meer bestanden om te downloaden naar de GUI en klik op Runs importeren. Bekijk de afbeelding voor de eerste put in het venster van de diavoorstellingsviewer in de GUI door op het > symbool links van de voorbeeldnaam te klikken en vervolgens de juiste leeservaring te selecteren door erop te dubbelklikken (leeswaarden worden weergegeven op basis van de datum en het type afbeelding- brightfield, UV-TPEF of SHG). Vergroot de afbeelding door het formaat van het hele venster te wijzigen. Het vak Afbeeldingsdetails bevat informatie over de afbeelding, inclusief de scoregegevens (leeg totdat de gelezen is gescoord). Het vak Cocktaildetails bevat metagegevens over de cocktailcomponenten. Ga naar het volgende vak door op de knop Volgende in het navigatiepaneel te klikken of op de pijltoets naar rechts op het toetsenbord te drukken. Navigeer naar een specifieke put door het putnummer in te voeren in het venster Op putnummer . Bekijk alle leeswaarden (van de gegevens die in de GUI zijn geïmporteerd) door het selectievakje Alle datums weergeven aan te vinken. Bekijk alle spectra (van de spectra die in de GUI zijn geïmporteerd) door het selectievakje Alle spectra weergeven aan te vinken. Klik op de knop Spectrum verwisselen om elk spectrumbeeld afzonderlijk te bekijken. Scoor de kristalafbeeldingen met behulp van het MARCO-algoritme door eerst een specifieke run uit de lijst aan de linkerkant van het venster te markeren. Klik vervolgens op de knop Geselecteerde uitvoering classificeren . Bekijk de MARCO-score-informatie in het venster Afbeeldingsdetails zodra een beeldweergave is gescoord voor alle 1.536 putten.OPMERKING: Classificatie duurt meestal tussen de 2-5 minuten, afhankelijk van de computersnelheid en het beschikbare geheugen. Het algoritme genereert scores die de inhoud classificeren in “kristal”, “helder”, “neerslag” of “andere” klassen. De numerieke waarden die zijn gekoppeld aan de classificatie van elke put weerspiegelen de waarschijnlijkheid dat de put objecten van die klasse bevat.Bekijk een subset van de gescoorde afbeeldingen door het gewenste vakje (en) aan te vinken in het deelvenster Beeldfiltering en op de knop Filters verzenden te klikken. Bekijk bijvoorbeeld alleen de afbeeldingen die door MARCO als kristallen zijn geclassificeerd door de vakjes Kristallen en MARCO aan te vinken en op Filters verzenden te klikken. Scoor handmatig de kristalafbeeldingen om de “human scored” set te genereren. Wijs een score toe aan een put door op de juiste knop te klikken (de knoppen “kristal”, “wissen”, “neerslaan” of “andere” bevinden zich in het deelvenster Classificatie onderaan het venster). U kunt ook het numerieke toetsenblok op het toetsenbord gebruiken om de score toe te wijzen (1 = “kristal”, 2 = “helder”, 3 = “neerslag”, 4 = “overig”). Een door mensen gescoorde afbeelding aanwijzen als een “favoriet” door de favoriet aan te vinken ? doos.OPMERKING: Bekijk alleen de afbeeldingen die door een mens als kristallen zijn geclassificeerd door de vakjes Kristallen en Mens aan te vinken en op Filters verzenden te klikken. Als u op het vak Favorieten in het deelvenster Filteren klikt, worden de geretourneerde afbeeldingen verder beperkt en worden alleen de door mensen gescoorde kristalafbeeldingen geretourneerd die ook favorieten zijn. Gebruik het tabblad Plaatviewer om meerdere putten tegelijk weer te geven. Selecteer op het tweede tabblad Plaatviewer in het deelvenster Besturingselementen 16, 64 of 96 afbeeldingen in het vervolgkeuzemenu in de sectie Afbeeldingen per plaat . Gebruik het tabblad Afbeeldingsfiltering om afbeeldingen grijs te maken die niet interessant zijn. Schakel het selectievakje Filter toepassen in om de afbeeldingen te filteren.OPMERKING: Selecteer bijvoorbeeld de vakken “menselijk” en “kristal” en alleen die putten die door een mens als kristal zijn gescoord, zijn gemakkelijk zichtbaar.Navigeer in het tabblad Plaatviewer door op de knop Volgende te klikken om de volgende set 16/64/96-afbeeldingen te bekijken. Standaard zijn afbeeldingen gescoord als kristallen rood, die gescoord als helder zijn blauw, die gescoord als neerslag zijn groen en die gescoord als andere zijn oranje. Wijzig de kleuren met behulp van de vervolgkeuzemenu’s. Selecteer de informatie die op de putten moet worden weergegeven door verschillende vakjes op het tabblad Labels aan te vinken. Klik op Weergave opslaan om een afbeeldingsbestand van de huidige weergave op te slaan. Klik op Spectrum verwisselen om te schakelen tussen brightfield-, SHG- en UV-TPEF-afbeeldingen voor de afbeelding met meerdere putten. Klik op Exporteren en selecteer het juiste bestandstype in het vervolgkeuzemenu om de gescoorde bestanden te exporteren voor gebruik in andere programma’s.OPMERKING: CSV-bestanden (door komma’s gescheiden waarden) zijn compatibel met spreadsheetprogramma’s zoals Microsoft Excel of Google Spreadsheets. JSON-bestanden (JavaScript Object Notation) kunnen met de meeste teksteditors worden geopend. PPTX (PowerPoint Presentation) kan worden gebruikt om afbeeldingen van Polo weer te geven, inclusief een vergelijking van brightfield-, UV-TPEF- en SHG-afbeeldingen. Bestanden worden opgeslagen in .xtal-indeling om opnieuw te worden geopend in de MARCO Polo GUI.Sla een .xtal-bestand op door boven aan de pagina op Bestand te klikken en vervolgens Uitvoeren opslaan of Uitvoeren opslaan als te selecteren. Geef een bestandsnaam en maplocatie op. Open .xtal-bestanden door te klikken op Importeren en afbeeldingen te selecteren en vervolgens Van opgeslagen uitvoering. Blader naar de juiste bestandslocatie, klik op de bestandsnaam en klik vervolgens op Openen.

Representative Results

De resultaten van het 1.536-well kristalscreeningexperiment bestaan uit zeven complete brightfield-beeldsets verzameld op dag 0 (negatieve controle), dag 1, week 1, week 2, week 3, week 4 en week 6 (figuur 4). SONICC-beelden worden verzameld op het tijdstip van 4 weken voor platen geïncubeerd bij 23 °C en op het tijdstip van 6 weken voor platen geïncubeerd bij 4 °C of 14 °C. Al met al kunnen gebruikers, zodra een monster is verzonden, verwachten dat hun platen binnen 1 dag na aankomst zijn ingesteld. De afbeeldingen worden geüpload terwijl ze worden verzameld. Het kristallisatiescreeningsexperiment eindigt na 6 weken. De 1.536-well plaatopstelling maakt het mogelijk om alle screeningsexperimenten binnen dezelfde plaat uit te voeren, waardoor het monsterverbruik wordt beperkt en beeldvorming en directe vergelijking tussen beeldvormingsmodaliteiten wordt vergemakkelijkt. Representatieve resultaten voor het tijdsverloop van kristalgroei voor een enkele cocktailconditie zijn weergegeven in figuur 4. Geautomatiseerde plaatbeeldvorming in de loop van het experiment maakt de identificatie van zowel snel als langzaam groeiende kristallen mogelijk door middel van brightfield-beeldvorming. De UV-TPEF- en SHG-beeldvorming maken kruisvalidatie van de treffers waargenomen door brightfield-beeldvorming mogelijk en geven aan dat de waargenomen kristallen respectievelijk eiwitachtig en kristallijn zijn (figuur 5A, B). Bovendien maakt SONICC-beeldvorming de identificatie mogelijk van kristallen die visueel worden verduisterd door neerslag of films (figuur 5C) of microkristallen die anders voor neerslag kunnen worden aangezien (figuur 5D). Voor sommige kristallen is een gebrek aan SHG-signaal niet diskwalificerend, omdat sommige puntgroepen geen SHG-signaal35,36 produceren, zoals geïllustreerd door het tetragonale thaumatinekristal in figuur 5C. Omgekeerd moet een gebrek aan UV-TPEF-signaal voor eiwitten zonder tryptofaanresiduen worden verwacht. De waarneming van UV-TPEF- en SHG-signalen vergemakkelijkt ook de identificatie van niet-eiwitzoutkristallen, die in het heldere veld verschijnen en een sterk positief SHG-signaal vertonen, maar geen UV-TPEF-signaal hebben (figuur 5E). Beeldanalyse voor de plaatopstelling is gestroomlijnd met de MARCO Polo GUI, die ook de ftp-gegevensoverdracht van de HWI-servers bundelt (als alternatief voor het overbrengen van bestanden met FileZilla). De MARCO Polo GUI maakt het mogelijk om gemakkelijk navigeerbare plaat- en beeldweergave uit te voeren en voert computationele beeldscores uit met behulp van het MARCO-algoritme, zodat de beeldresultaten snel kunnen worden gedownload, bekeken en geanalyseerd vanuit het HTX Center. Het MARCO-scorealgoritme, zoals geïmplementeerd in de MARCO Polo GUI, is in staat om beelden van de volledige 1.536-putplaat in minder dan 5 minuten te scoren. Afbeeldingen die door het MARCO-algoritme als kristallijn zijn gemarkeerd, kunnen vervolgens door de Polo GUI worden gesorteerd voor weergave. Omdat het MARCO-algoritme is geoptimaliseerd voor kristalidentificatie en het minimaliseren van valse negatieven om geen positieve treffers te missen, kan de score resulteren in vals-positieve vlaggen. Niettemin resulteert het vermogen van MARCO om de reeks beelden die moeten worden onderzocht te beperken door de aandacht te richten op de putten met een grote kans op kristallen te bevatten, in een aanzienlijke vermindering van de gegevensverwerkingslast voor gebruikers. De handige implementatie van het algoritme in het gebruiksvriendelijke MARCO Polo-weergaveplatform, met zijn mogelijkheid om afbeeldingen te sorteren op basis van MARCO-scores, verbetert het vermogen van de gebruiker om de dataset snel te analyseren en kristaltreffers nauwkeurig te bepalen aanzienlijk. Figuur 1: Schema van een high-throughput 1.536-well kristallisatie screening experiment uitgevoerd in het HTX Center. (1) In deze stap worden 5 μL paraffineolie en 200 nL cocktail aan elke put toegevoegd (protocolstap 3.1 en stap 3.5). Een cartoonillustratie van een put met alleen olie en cocktail en een representatieve afbeelding worden rechts getoond. (2) Monsters komen aan bij het HTX Center (protocol stap 5.1). 3) In deze stap wordt 200 nL monster toegevoegd aan elke put (protocolstap 5.4). (4) Alle 1.536 putten worden in de loop van de tijd gemonitord met behulp van brightfield-beeldvorming, 5) evenals de UV-TPEF- en SHG-modaliteiten (protocolstap 6). 6) De AI-enabled open-source GUI wordt gebruikt om de kristallisatiebeelden te bekijken, te scoren en te analyseren (protocolstap 7). Afkortingen: HTX = high-throughput kristallisatie; UV-TPEF = UV-twee-foton geëxciteerde fluorescentie; SHG = tweede harmonische generatie; AI = kunstmatige intelligentie; GUI = grafische gebruikersinterface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Enkele 1.536-putplaten met screeningsexperimenten, afgebeeld met behulp van brightfield-, UV-TPEF- en SHG-beeldvorming. De 1.536-putplaten worden getoond met een Amerikaanse stuiver voor schaal (boven). Elk screeningsexperiment wordt één keer afgebeeld voorafgaand aan de installatie en zes keer na toevoeging van het monster met brightfield-beeldvorming (zeven totale brightfield-beeldsets, links). De platen ondergaan UV-TPEF (midden) en SHG (rechts) beeldvorming na 4 weken of 6 weken. Afkortingen: UV-TPEF = UV-twee-foton geëxciteerde fluorescentie; SHG = tweede harmonische generatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Schematisch dat laat zien hoe de 1.536-putplaten worden gegenereerd. Zestien DW-blokken met 96 putten worden gebruikt om vier 384-putplaten uit te stempelen, waarbij elk kwadrant van elke 384-putplaat wordt gevuld door kristallisatiecocktails af te geven. Vier DW-blokken met 96 putten vullen één 384-putplaat (midden). Vier 384-putplaten worden gebruikt om de enkele 1.536-putplaat uit te stempelen (rechts). Afkorting: DW = diepe put. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Representatief tijdsverloop van een enkele put in een screeningsexperiment met 1.536 putten. Platen worden afgebeeld voorafgaand aan het instellen van het monster (dag 0), evenals met brightfield-beeldvorming op dag 1, week 1, week 2, week 3, week 4 en week 6. De platen geïncubeerd bij 23 °C worden in week 4 in beeld gebracht met SONICC. Schaalstaven = 80 μm (brightfield), 200 μm (SHG, UV-TPEF). Afkortingen: SONICC = tweede orde niet-lineaire beeldvorming van chirale kristallen; UV-TPEF = UV-twee-foton geëxciteerde fluorescentie; SHG = tweede harmonische generatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Representatieve beeldvormingsresultaten voor de HT 1.536 kristalscreeningexperimenten. Brightfield-, UV-TPEF- en SHG-beeldvormingsresultaten worden getoond voor vijf voorbeeldputten. (A,B) Eiwitkristallen waargenomen door brightfield, UV-TPEF en SHG-beeldvorming zijn duidelijk zichtbaar in alle drie de beeldvormingsmodaliteiten. (C) Een eiwitkristal dat door film in brightfield-beeldvorming wordt verduisterd, is zichtbaar door UV-TPEF-beeldvorming; het kristal wordt niet waargenomen door SHG-beeldvorming vanwege incompatibiliteit van de puntgroep. (D) Voorbeeld van microkristallen geverifieerd door UV-TPEF- en SHG-beeldvorming die anders als neerslag kunnen worden beschouwd. (E) Voorbeeld van zoutkristallen die kristallijn lijken door brightfield- en SHG-beeldvorming, maar geen UV-TPEF-signaal vertonen. Schaalstaven = 200 μm. Putdiameter = 0,9 mm. Afkortingen: UV-TPEF = UV-twee-foton geëxciteerde fluorescentie; SHG = tweede harmonische generatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende figuur S1: Afbeeldingsbestanden openen in MARCO Polo. Afbeeldingsbestanden kunnen worden geopend binnen de MARCO Polo GUI door te navigeren naar de Import | Tabblad Afbeeldingen bovenaan (a). Merk op dat bestanden ook kunnen worden overgedragen via de From FTP-tool rechtstreeks in MARCO Polo (a) of kunnen worden overgedragen via FileZilla zoals beschreven in protocolstap 7.2. Als u bestanden wilt importeren die al zijn gedownload, selecteert u Afbeeldingen | Van rar archief / directory. Selecteer in het pop-upvenster dat verschijnt Bladeren naar map (b) en navigeer naar de bestandsmap waar de plaatafbeeldingsbestanden zijn opgeslagen. Zodra de bestanden zich in het venster Geselecteerde paden (c) bevinden, markeert u een bestand en klikt u op Uitvoeren importeren (d). De MARCO Polo GUI identificeert de juiste metagegevens van het cocktailbestand om met de afbeeldingen te importeren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De methode beschrijft een pijplijn met hoge doorvoer voor eiwitkristallisatiescreening die slechts 500 μL monster vereist voor 1.536 individuele kristallisatie-experimenten in het microbatch-onder-olieformaat. De pijplijn vertrouwt op vloeistofverwerkingsrobotica om de experimentele opstelling snel en reproduceerbaar te ondersteunen, evenals de computationele beeldanalysebron MARCO Polo, die is aangepast om plaatafbeeldingen met 1.536 putten te analyseren met behulp van het MARCO-algoritme om kristaltreffers te identificeren en te isoleren.

Het kleine volume van individuele screeningsdruppels (400 nL totaal met een 1:1 verhouding van sample:cocktail) betekent dat extreem kleine monstervolumes nodig zijn om positieve kristallisatiecondities te identificeren. Deze kleine druppelgroottes produceren noodzakelijkerwijs kleine kristallen die niet kunnen worden gevist door traditionele looping. Er zijn methoden ontwikkeld om van de 1.536 platen³⁷ te oogsten; Bovendien zijn de platen met kristallen direct bij synchrotronbronnen gebruikt voor in situ gegevensverzameling³⁸. Als een robuuste methode voor het oogsten van deze kristallen zou worden ontwikkeld, zouden vooruitgang in synchrotrontechnologie en microgerichte bundels het verder mogelijk maken om nuttige datasets te verkrijgen. Bovendien kunnen de verkregen kristallen mogelijk worden gebruikt als zaden voor optimalisatie-inspanningen.

SONICC-beeldvorming is duidelijk voordelig bij het identificeren van zowel kleine eiwitkristallen als eiwitkristallen die verborgen zijn onder neerslag. Ondanks deze voordelen zijn niet alle monstertypen vatbaar voor SHG- en UV-TPEF-beeldvorming. Eiwitten met weinig of geen aromatische tryptofaanresiduen vertonen bijvoorbeeld een dubbelzinnig UV-TPEF-signaal. Bovendien zullen kristallen in specifieke ruimtegroepen, waaronder centrosymmetrische groepen of puntgroep 432, niet worden gedetecteerd door SHG-beeldvorming. Monsters met fluoroforen interfereren soms met het SHG-signaal, wat resulteert in de annulering van het signaal of verhoogde intensiteit, wat betekent dat een zorgvuldige interpretatie van SHG-signalen vereist is voor metaalbevattende eiwitten en eiwitten die fluorescerende moieties bevatten. In veel gevallen is het echter mogelijk om de afwezigheid van een SHG- of UV-TPEF-signaal te rationaliseren, en het ontbreken van deze signalen hoeft niet noodzakelijkerwijs de aanwezigheid van een eiwitkristal uit te sluiten.

Het microbatch-onder-olieformaat biedt een alternatief voor de meer gebruikelijke dampdiffusiemethode die wordt gebruikt voor kristallografie met hoge doorvoer. Belangrijk is dat het kristallisatieformaat van invloed is op hitidentificatie³⁹, wat een reden biedt voor het gebruik van verschillende kristallisatieformaten voor screeningsinspanningen met hoge doorvoer. Geautomatiseerde beeldvorming en SONICC-modaliteiten helpen bij de snelle identificatie van eiwitkristallen gedurende het experimentele tijdsverloop van 6 weken. Ten slotte stelt de MARCO Polo GUI gebruikers in staat om snel beelden van 1.536 omstandigheden te analyseren om veelbelovende hitputten te identificeren voor optimalisatie. De mogelijkheden van het HTX Center, inclusief de robotica-enabled high-throughput experimentele opstelling, in combinatie met de state-of-the-art beeldvormings- en computationele hulpmiddelen voor analyses, leveren een belangrijke bijdrage aan de structurele biologiegemeenschap door onderzoekers in staat te stellen effectief een primair knelpunt in op kristal gebaseerd structureel werk aan te pakken: het vinden van kristallisatiecondities.

Materials

1536 Well Imp@ct LBR LoBase	Greiner Bio-One	790 801
Acetic acid	Hampton Research	HR2-853
AlumaSeal II Sealing Film	Hampton Research	HR8-069
Ammonium bromide	Molecular Dimensions	MD2-100-247
Ammonium chloride	Hampton Research	HR2-691
Ammonium hydroxide	Hampton Research	HR2-855
Ammonium nitrate	Hampton Research	HR2-665
Ammonium phosphate dibasic	Hampton Research	HR2-629
Ammonium phosphate monobasic	Hampton Research	HR2-555
Ammonium sulfate	Hampton Research	HR2-541
Ammonium thiocyanate	Molecular Dimensions	MD2-100-301
Bicine pH 9.0	Hampton Research	HR2-723
Bis-tris propane pH 7.0	Hampton Research	HR2-993-08
Calcium acetate	Hampton Research	HR2-567
Calcium chloride dihydrate	Hampton Research	HR2-557
CAPS pH 10.0	Rigaku Reagents	none given
ClearSeal Film	Hampton Research	HR4-521
Cobalt sulfate heptahydrate	Molecular Dimensions	MD2-100-42
Crystal Screen HT screen	Hampton Research	HR2-130
Formulator	Formulatrix
Glycerol	Hampton Research	HR2-623
Gryphon liquid handling robot	Art Robbins Instruments
HEPES pH 7.0	Hampton Research	HR2-902-03
HEPES pH 7.5	Hampton Research	HR2-902-08
HWI HTX Center sample submission form			https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/
Hydrochloric acid	Hampton Research	HR2-581
Index HT screen	Hampton Research	HR2-134
Ionic Liquid screen	Hampton Research	HR2-214
Lithium bromide	Molecular Dimensions	MD2-100-312
Lithium chloride	Hampton Research	HR2-631
Lithium sulfate monohydrate	Hampton Research	HR2-545
Magnesium acetate tetrahydrate	Hampton Research	HR2-561
Magnesium chloride hexahydrate	Hampton Research	HR2-559
Magnesium nitrate hexahydrate	Hampton Research	HR2-657
Magnesium sulfate heptahydrate	Hampton Research	HR2-821
Manganese chloride tetrahydrate	Millipore Sigma	63535-50G
Manganese sulfate monohydrate	Molecular Dimensions	MD2-100-310
MARCO Polo GUI download			https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/
Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot	Thermo Scientific
MES pH 6.0	Hampton Research	HR2-943-09
Mosquito liquid handling robot	SPTLabtech
Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F	Sigma Aldrich	PX0045-3
PEG 1000	Hampton Research	HR2-523
PEG 2000	Hampton Research	HR2-592
PEG 20000	Hampton Research	HR2-609
PEG 3350	Hampton Research	HR2-527
PEG 400	Hampton Research	HR2-603
PEG 4000	Hampton Research	HR2-529
PEG 6000	Hampton Research	HR2-533
PEG 8000	Hampton Research	HR2-535
PEG/Ion HT screen	Hampton Research	HR2-139
PEGRx HT screen	Hampton Research	HR2-086
Plate reservations			htslab@hwi.buffalo.edu
Potassium acetate	Hampton Research	HR2-671
Potassium bromide	Hampton Research	HR2-779
Potassium carbonate	Molecular Dimensions	MD2-100-311
Potassium chloride	Hampton Research	HR2-649
Potassium nitrate	Hampton Research	HR2-663
Potassium phosphate dibasic	Hampton Research	HR2-635
Potassium phosphate-monobasic	Hampton Research	HR2-553
Potassium phosphate-tribasic	Molecular Dimensions	MD2-100-309
Potassium thiocyanate	Hampton Research	HR2-695
Rock Imager 1000 with SONICC	Formulatrix
Rock Imager 54	Formulatrix
Rubidium chloride	Millipore Sigma	R2252-10G
SaltRx HT screen	Hampton Research	HR2-136
Silver Bullets screen	Hampton Research	HR2-096
Slice pH screen	Hampton Research	HR2-070
Sodium acetate pH 5.0	Hampton Research	HR2-933-15
Sodium bromide	Hampton Research	HR2-699
Sodium chloride	Hampton Research	HR2-637
Sodium citrate pH 4.2	Hampton Research	HR2-935-01
Sodium citrate pH 5.6	Hampton Research	HR2-735
Sodium hydroxide	Hampton Research	HR2-583
Sodium molybdate dihydrate	Molecular Dimensions	MD2-100-207
Sodium nitrate	Hampton Research	HR2-661
Sodium phosphate monobasic	Hampton Research	HR2-551
Sodium thiosulfate pentahydrate	Molecular Dimensions	MD-100-307
StockOptions Polymer screen	Hampton Research	HR2-227
Tacsimate pH 7	Hampton Research	HR2-755
TAPS pH 9.0	bioWORLD	40121071
Tris pH 8	Hampton Research	HR2-900-11
Tris pH 8.5	Hampton Research	HR2-725
ViaFLO 384	Integra
ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL)	Integra
ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL)	Integra
Zinc acetate dihydrate	Hampton Research	HR2-563