단백질 결정학을 위한 결정 적중을 얻기 위한 고처리량 스크리닝

Summary

이 프로토콜은 1,536개의 미세분석 플레이트 준비에서 6주간의 실험 기간 종료에 이르는 고처리량 결정화 스크리닝을 자세히 설명합니다. 시료 설정, 얻은 이미징 및 사용자가 인공 지능 지원 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 분석을 수행하여 거대분자 결정화 조건을 빠르고 효율적으로 식별하는 방법에 대한 세부 정보가 포함되어 있습니다.

Abstract

X선 결정학은 거대분자 구조를 식별하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 기술이지만, 단백질을 회절에 적합한 정렬된 격자로 결정화하는 중요한 단계는 여전히 어려운 일입니다. 생체 분자의 결정화는 대체로 실험적으로 정의되며, 이 과정은 노동 집약적일 수 있으며 자원이 제한된 기관의 연구자에게는 금지될 수 있습니다. 국립 고처리량 결정화(HTX) 센터에서는 광범위한 결정화 파라미터를 샘플링하도록 설계된 자동화된 고처리량 1,536웰 마이크로배치 언더오일 플레이트 설정을 포함하여 결정 성장을 촉진하기 위해 재현성이 높은 방법을 구현했습니다. 플레이트는 6주 동안 최첨단 이미징 양식을 사용하여 모니터링되어 결정 성장에 대한 통찰력을 제공하고 귀중한 수정 히트를 정확하게 구별합니다. 또한 결정 히트를 식별하기 위한 훈련된 인공 지능 스코어링 알고리즘의 구현과 실험 이미지를 볼 수 있는 오픈 소스의 사용자 친화적인 인터페이스가 결합되어 결정 성장 이미지 분석 프로세스를 간소화합니다. 여기에서는 칵테일 및 결정화 플레이트의 준비, 플레이트 이미징 및 재현성을 보장하고 성공적인 결정화 가능성을 높이는 방식으로 히트를 식별하기 위한 주요 절차 및 기기에 대해 설명합니다.

Introduction

구조 생물학 방법이 엄청나게 발전한 시대에도 X선 결정학은 거대분자의 고품질 구조 모델을 생성하기 위한 신뢰할 수 있고 인기 있는 방법입니다. 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 기탁된 모든 3차원 구조 모델의 85% 이상이 결정 기반 구조 방법(2023년 1월 기준)에서 나온 것입니다. ¹ 또한, X선 결정학은 약물 발견 및 개발 과정의 중요한 구성 요소인 단백질-리간드 구조를 해결하는 데 없어서는 안 될 필수 요소입니다². 단백질 결정화가 반세기 이상 지배적인 구조 생물학 기술로 남아 있었음에도 불구하고, 물리적 특성³ 또는 서열 ^4,5를 기반으로 결정화 가능성을 예측하는 방법은 아직 초기 단계에 있습니다.

결정화 조건의 예측은 훨씬 더 모호합니다. 모델 단백질 ^6,7에 대해서도 가능한 결정화 조건을 예측하기 위해 제한된 진전이 이루어졌습니다. 다른 연구에서는 PDB ^8,9,10에서 채굴된 단백질 상동성 및 조건을 기반으로 결정화 조건을 확인하려고 시도했습니다. 그러나 PDB에서 찾을 수 있는 예측력은 최종적이고 성공적인 결정화 조건만 증착되기 때문에 제한적이며, 이는 필요에 따라 결정 성장을 미세 조정하는 데 필요한 광범위한 최적화 실험을 놓치게 됩니다. 또한, 많은 PDB 엔트리들은, 칵테일 공식들, 결정화 포맷, 온도, 및 결정화하기 위한 시간(^{11, 12})을 포함하는 이들 세부사항들을 포함하는 메타데이터를 결여한다. 따라서 많은 관심 단백질의 경우 결정화 조건을 결정하는 가장 접근하기 쉬운 방법은 광범위한 화학적 가능성에 걸쳐 가능한 한 많은 조건을 사용하여 실험적으로 결정하는 것입니다.

결정화 스크리닝을 가능한 한 유익하고 철저하게 만들기 위한 몇 가지 접근법이 큰 효과를 내기 위해 연구되었는데, 여기에는 희소 매트릭스 13, 불완전 요인 스크리닝 14, 첨가제^{15, 16}, 파종 17 및 핵 형성제 ¹⁸이 포함된다. Hauptman-Woodward Medical Research Institute(HWI)의 국립 HTX 센터(National HTX Center)는 비교적 적은 양의 시료 및 칵테일 부피를 사용하여 초기 결정화 조건의 식별을 간소화하기 위해 자동화된 액체 처리 및 이미징 방식을 활용하는 마이크로배치-언더-오일 접근법(microbatch-under-oil-approach¹⁹)을 사용하여 결정화 스크리닝을 위한 효율적인 파이프라인을 개발했습니다(그림 1). 1,536개의 독특한 칵테일 세트는 단백질 결정 성장에 도움이 되는 것으로 이전에 결정된 조건에 기초하며, 가능한 결정화 조건의 넓은 범위를 샘플링하기 위해 화학적으로 다양하도록 설계된다^(20,21,22). 결정화 조건의 광범위한 샘플링은 하나 이상의 결정화 리드를 관찰할 가능성을 높입니다.

스크리닝에 얼마나 많은 조건이 필요한지에 대한 공식적인 분석은 문헌에 거의 나타나지 않았습니다. 한 연구에서는 서로 다른 스크린의 샘플링 레이아웃에 초점을 맞추었고 구성 요소의 무작위 샘플링(불완전한 요인과 유사)이 가장 철저하고 효율적인 샘플링 방법을 나타낸다는 것을 발견했습니다²³. 스크리닝에 대한 또 다른 연구는 매우 철저한 1,536개의 스크린이 단 하나의 결정 히트(²⁴)만을 산출하는 수많은 사례가 있었다는 것을 언급했으며, 매우 최근의 연구에서는 대부분의 상업용 스크린이 스크리닝 히트(²⁵)와 관련된 것으로 알려진 결정화 공간을 과소 샘플링한다는 점을 강조했다. 모든 결정화 리드가 결정 내 고유한 무질서, 회절 제한 또는 결정 결함으로 인해 데이터 수집에 적합한 회절 품질 결정을 생성하는 것은 아닙니다. 따라서 조건에 대해 더 넓은 그물을 주조하면 최적화를 위한 대체 결정 형태를 제공하는 추가적인 이점이 있습니다.

단백질 결정화 실험의 형식도 스크린의 성공에 영향을 미칩니다. 증기 확산은 고처리량 결정화 응용 분야에 가장 일반적으로 사용되는 설정이며 EMBL 함부르크 및 파스퇴르 연구소 고처리량 스크리닝 센터^26,27,28을 포함한 최첨단 결정화 센터에서 활용됩니다. HTX 센터는 마이크로 배치 언더 오일 방법을 사용합니다. 덜 일반적으로 사용되지만, 샘플 및 결정화 칵테일^20,21,22의 소비를 최소화하는 강력한 방법입니다. 마이크로 배치-언더-오일 방법의 한 가지 이점은, 특히 고점도 파라핀 오일을 사용할 때, 실험 중 방울 내에서 약간의 증발만 발생한다는 것인데, 이는 방울 혼합 시 평형 농도가 달성됨을 의미합니다. 마이크로 배치-언더-오일 분석법에서 양의 결정화 결과가 관찰되는 경우, 이러한 조건의 재현은 일반적으로 결정화 방울과 저장소 사이의 평형 중에 정의되지 않은 지점에서 결정화가 발생하는 증기 확산 설정보다 더 간단합니다. 적중의 재현성은 일반적으로 단결정 X선 실험에 최적화해야 하는 엄청나게 작은 단백질 결정을 생성하는 고처리량 결정화 접근법에 바람직합니다.

가용성 단백질에 대한 고처리량 결정화 스크린은 사내에서 제조되는 칵테일, 기성품 상업용 스크린 및 자체 개질된 상업용 스크린(²²)으로 구성된다. 칵테일은 초기에 이전에 성공한 결정화 칵테일²⁰을 사용하여 불완전한 요인 전략을 사용하여 개발되었다. 상업적으로 이용 가능한 스크리닝의 시약에는 폴리머 어레이, 결정화 염, PEG 및 이온 조합과 희소 매트릭스 및 불완전한 요인 접근법을 활용하는 스크리닝이 포함됩니다. 또한 스크리닝에 포함되기 전에 변형되는 시약이 있습니다: 첨가제 스크리닝, pH 및 완충액 스크린, 이온성 액체 첨가제 스크린, 및 폴리머 스크린.

알려진 결정화 조건 및 전략의 힘은 1,536개의 결정화 칵테일에서 활용되었으며, 자동화된 액체 처리, 자동화된 명시야 이미징 및 키랄 결정의 2차 비선형 이미징(SONICC)을 사용하는 파이프라인을 생성하기 위해 마이크로 배치-언더-오일 시스템의 이점과 함께 활용되었습니다. 액체 취급 및 이미징의 자동화는 습식 실험실 시간을 줄이고 재현성을 높이는 이점을 제공합니다. 자동 결정화 스크리닝의 고처리량 특성으로 인해 결정 성장 모니터링 프로세스의 자동화가 필요합니다. 이러한 발전은 양성 결정 히트를 식별하는 데 도움이 되는 최첨단 이미징 기술로 달성됩니다. 플레이트의 표준 명시야 이미징과 향상된 검출을 위한 다광자 분석법은 모두 SONICC의 수정 이미징 시스템을 통해 사용됩니다(그림 2). SONICC는 2차 고조파 생성(SHG)²⁹ 현미경과 자외선 2광자 여기 형광(UV-TPEF)³⁰ 현미경을 결합하여 매우 작은 결정과 침전물에 의해 가려진 결정을 검출합니다. SONICC 이미징은 웰에 단백질(UV-TPEF를 통해)과 결정(SHG를 통해)이 포함되어 있는지 여부를 알려줍니다. 단백질 결정의 양성 식별 외에도 최첨단 이미징 방법을 사용하여 추가 정보를 얻을 수도 있습니다. 샘플 추가 전의 칵테일 전용 이미징은 음성 대조군으로 사용됩니다. 이러한 이미지는 염 결정 및 파편을 포함하여 샘플 추가 전의 웰 외관을 식별할 수 있습니다. 추가적으로, SHG 및 UV-TPEF 이미징은 염 결정으로부터 단백질 결정을 구별하는 것을 돕고, 단백질-핵산 복합체 물질³¹을 시각화하는데 사용될 수 있다.

이미징을 통해 반복적으로 모니터링되는 고처리량 결정화 실험은 검사가 필요한 매우 많은 양의 이미지를 생성합니다. 자동화된 크리스탈 스코어링 방법은 사용자의 부담을 줄이고 양성 크리스탈 히트를 식별할 확률을 높이기 위해 개발되었습니다. HTX 센터는 명시야 우물 이미지를 분류하기 위해 학계, 비영리, 정부 및 업계 파트너의 컨소시엄이 개발한 훈련된 심층 컨볼루션 신경망 아키텍처인 MARCO(MAchine Recognition of Crystallization Outcomes) 스코어링 알고리즘 개발에 참여했습니다³². 이 알고리즘은 서로 다른 결정화 방법과 서로 다른 이미저를 사용하는 여러 기관의 결정화 실험에서 얻은 거의 500만 개의 명시야 이미지에 대해 훈련되었습니다. 이 알고리즘은 주어진 이미지가 “crystal”, “clear”, “precipitate” 및 “other”의 네 가지 가능한 이미지 클래스에 속하는지 여부를 나타내는 확률적 점수를 출력합니다. MARCO의 분류 정확도는 94.5%입니다. 크리스털 검출은 알고리즘을 구현하고, 접근가능하고 간단한 이미지 보기를 위한 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 제공하는 소프트웨어에 의해 더욱 향상되며, AI 지원 스코어링 능력^(32,33)으로 가능해진다. MARCO Polo GUI는 HTX 센터의 이미징 및 데이터 관리 시스템 설정과 원활하게 작동하여 1,536웰 스크린에서 히트를 식별하고 사람의 참여를 통해 정렬된 목록의 출력을 검사하도록 설계되었습니다. 또한 GitHub에서 사용할 수 있는 오픈 소스 소프트웨어인 GUI는 다른 실험실 그룹의 특정 요구 사항을 반영하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다.

여기에서는 칵테일과 단백질을 모두 전달하기 위해 로봇 액체 처리를 사용하여 고처리량 마이크로 배치 언더 오일 실험을 설정하는 과정을 설명합니다. HTX 센터는 관심 있는 사용자에게 선별 서비스와 교육 리소스를 제공하는 것을 목표로 다른 기관에서는 볼 수 없는 고유한 도구 및 리소스를 보유하고 있습니다. 로봇 공학 지원 고 처리량 기술의 방법과 기능을 시연하면 커뮤니티가 사용 가능한 기술에 대한 지식을 얻고 자체 구조 결정 노력에 대한 결정을 내릴 수 있습니다.

Protocol

1. 16 개의 96 웰 깊은 우물 블록을위한 칵테일 준비 또는 구매 96웰 깊은 우물(DW) 블록에 분주하여 사내에서 생성된 화학 칵테일을 준비합니다. 로봇 액체 처리기를 사용하여 소금, 완충액, 폴리머 및 물의 저장 용액을 분배하고 혼합합니다. 로봇 식 액체 처리기 또는 멀티 채널 피펫을 사용하여 사내에서 수정 된 화학 칵테일을 준비하여 상업적으로 구매 한 96 웰 DW 블록 스크린에 추가 구성 요소를 추가합니다. 시중에서 판매되는 DW 블록을 구입합니다. 라벨이 부착된 96웰 DW 블록을 -20°C에서 12-18개월 동안 보관합니다.참고: 1.1단계에서 준비한 칵테일. 및 1.2. 10/16 96웰 DW 블록을 채우고 5/16 96웰 DW 블록을 구매 시 사용합니다. 첨가제 스크린의 침전을 방지하기 위해 1,536웰 플레이트 디스펜싱 시 스크린에 하나의 96웰 DW 블록이 설정됩니다(섹션 3 참조). 2. 칵테일을 384웰 플레이트에 분배 96웰 DW 블록을 4°C에서 밤새 해동합니다. 384웰 플레이트 준비를 시작하기 전에 실온(20-23°C)으로 가져옵니다.알림: 실온은 칵테일 플레이트를 준비하는 데 적합합니다. 이러한 플레이트를 준비할 때 가장 중요한 것은 액체 처리 장치를 막히게 하고 칵테일 성분의 농도에 예측할 수 없는 변화를 일으킬 수 있는 침전물을 피하는 것입니다. 잔류성 불투명 침전물을 용해시키기 위해 필요에 따라 반전으로 블록을 완전히 혼합합니다. 우물에 침전물이 포함되어 있으면 블록을 30°C로 따뜻하게 하여 용해시킵니다. 96 주사기 또는 피펫 헤드가 장착된 액체 처리 로봇을 사용하여 4개의 96웰 DW 블록에서 1개의 384웰 플레이트로 50μL의 칵테일 용액을 전달합니다. 4개의 96웰 DW 블록은 사분면이 채워지도록 384웰 플레이트에 스탬핑됩니다(예: 96-DW1의 A1 내지 384-플레이트1의 A1, 96-DW2의 A1 내지 384-플레이트1의 B1 등) (그림 3). 16개의 96웰 DW 블록 중 15개를 384웰 플레이트에 전달하여 보관할 수 있습니다. 384웰 플레이트를 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하여 1,536웰 플레이트를 준비하는 데 사용합니다. 3. 오일 및 결정화 칵테일로 1,536웰 플레이트 준비 느린 흡인 및 전달 능력을 갖춘 로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 1,536웰 플레이트의 각 웰에 5μL의 파라핀 오일을 전달합니다. 오일 플레이트를 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 섹션 2의 384웰 플레이트를 4°C에서 밤새 해동합니다. 플레이트를 뒤집어 용액을 혼합하고 침전물을 용해시킵니다. 플레이트를 30°C에서 인큐베이션하여 잔류성 침전물을 용해시킨다. 첨가제 스크리닝 성분을 준비하기 위해, 0.1 M HEPES pH 6.8, 30% PEG3350을 함유하는 최종 96-웰 DW 블록을 사용하여 액체 취급 로봇 또는 멀티채널 피펫을 사용하여 상용 첨가제 스크린과 혼합한다. 3.3단계에서 제조된 완충된 PEG3350 용액과 첨가제 스크린의 1:1 혼합물을 적절한 384웰 플레이트에 최종 부피 50μL로 분주하여 첨가제 스크린 용액을 준비합니다. 384 주사기 또는 피펫 헤드가 장착된 액체 처리 로봇을 사용하여 200nL의 칵테일 용액을 1,536웰 플레이트의 각 웰에 전달합니다. 사분면이 채워지도록 4개의 384웰 플레이트를 1,536웰 플레이트에 스탬핑합니다(예: 384-플레이트1의 A1 내지 1,536-웰 플레이트의 A1, 384-플레이트1의 A2 내지 1,536-웰 플레이트의 A3 등). (그림 3). 플레이트를 150 × g 에서 5분 동안 원심분리한 후 4°C에서 최대 4주 동안 보관합니다. 4. 샘플 제출 샘플을 제출하려면 다가오는 상영 실행에 대한 예약 마감일 전에 예약 이메일을 보내십시오. 스크리닝 실험 횟수, 이름, PI 및 기관뿐만 아니라 샘플에 대한 특별한 취급 요구 사항을 포함합니다. 스크리닝 실행은 약 한 달에 한 번 수행되므로 연간 12회 실행됩니다. 샘플을 배송하기 전에 샘플 제출 양식을 작성하십시오.새 사용자의 경우 섹션 7의 결정화 이미지를 다운로드하는 데 사용할 암호를 선택합니다. 설정된 사용자의 경우 기존 암호를 사용하거나 이 단계에서 암호를 변경합니다. 1.5mL 튜브에 샘플을 제출합니다. 거대분자가 균질하고 결정화를 촉진하기 위해 적절하게 농축되었는지 확인합니다. 일반적으로 황산 암모늄 또는 PEG 4,000으로 구성된 사전 결정화 테스트를 사용하여 테스트 된 샘플 농도가 명확한 방울 또는 침전물34를 초래하는지 관찰하여 적절한 샘플 농도를 조사하십시오.참고: 순도와 균질성을 확인하기 위해 샘플을 제출하기 전에 수행할 수 있는 적절한 품질 테스트에는 SDS-PAGE, 겔 여과 및 동적 광 산란(DLS) 등이 포함됩니다. 결정화는 심지어 작은 불순물의 존재에 의해 영향을받을 수 있습니다. 현재 1,536웰 플레이트 1개를 설정하려면 500μL의 시료량이 필요합니다. 샘플 부피 요구 사항을 줄이기 위한 테스트가 진행 중입니다.50mM보다 큰 버퍼 농도와 스크린 내에서 결정화될 수 있는 인산염을 사용하지 마십시오. 글리세롤 농도가 10% w/v를 초과하는 과도한 가용화제를 피하십시오. 밀봉된 용기에 드라이아이스, 웨트아이스 또는 냉각 팩을 사용하여 적절한 온도를 안전하게 유지하기 위해 샘플을 포장합니다. 실행 중 월요일-수요일에 밤새 샘플 우선 순위를 배송합니다. 샘플이 배송되면 추적 번호를 이메일로 보내주십시오. 5. 준비된 1,536웰 플레이트에서 샘플 설정 시료의 포장을 풀고 사용자가 요청한 온도에서 즉시 배양합니다. 해동되면 샘플을 10,000× g 에서 실온에서 2분 동안 원심분리합니다. 샘플을 육안으로 관찰하여 침전, 색상 및 설정 전에 샘플의 상태를 식별합니다. 1,536-웰 플레이트를 23°C로 예열하고 150 × g 에서 5분 동안 원심분리한다. 명시야 이미징을 음성 대조군으로 사용하여 칵테일 전용 플레이트를 이미지화합니다.참고: 모든 플레이트는 샘플 설정 전에 명시야 이미징으로 이미지화되며, 이를 통해 샘플 전에 이미 결정 또는 파편이 있는 웰을 식별할 수 있습니다.amp음성 대조군으로 추가합니다. 또한, 결정화 칵테일이 전달 되지 않은 웰을 식별할 수 있습니다. 플레이트를 실온으로 예열하면 플레이트 표면의 응결이 제거되어 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 액체 처리 로봇을 사용하여 1,536웰 플레이트의 각 웰에 200nL의 시료를 분주합니다. 플레이트를 150 × g 에서 원심분리하고 플레이트를 4°C, 14°C, 또는 23°C에서 배양합니다.참고: Microbatch 언더오일 실험은 원하는 오일 아래에 단백질과 칵테일을 분배하여 손으로 설정할 수 있습니다. 그러나 재현 가능한 결과를 얻으려면 각 단백질과 칵테일을 1μL 이상 사용하는 것이 좋습니다. 6. 결정 형성을 위한 1,536웰 플레이트 모니터링 샘플을 1,536웰 플레이트에 추가한 후 1일차와 1주차, 2주차, 3주차, 4주차, 6주차에 명시야 이미징으로 이미지를 촬영합니다. 23°C에서 배양되는 플레이트의 경우 4주 시점에서, 14°C 또는 4°C에서 배양되는 플레이트의 경우 6주 시점에서 SHG 및 UV-TPEF를 사용하여 SONICC 이미징을 수행합니다.참고: SONICC 이미징의 타이밍은 일반적으로 해당 시점에 결정이 나타나기 때문에 고처리량 1,536 미세 분석 플레이트의 경우 4주 및 6주 시점으로 예정되어 있습니다. 오일 또는 증기 확산 실험에서 96웰 마이크로 배치로 수정하려면 시간 창에서 더 일찍 SONICC 이미징을 수행하는 것이 좋습니다. 내부 LIMS 시스템을 사용하여 사용자 계정으로 자동 전송된 실험 이미지에 액세스합니다. 자동화된 htslab 이메일 데몬을 통해 사용자에게 이미징이 발생했음을 알립니다. 7. 이미지 분석 HWI ftp 사이트에서 각 .rar 파일에 대한 스크리닝 이미지를 검색합니다.참고: 1,536 화면의 이미지 출력으로 인해 명시야 이미지, SHG 이미지 및 UV-TPEF 이미지가 포함된 여러 파일이 생성됩니다. 각 이미징 형식 또는 시점은 별도의 .rar 파일입니다. 각 .rar 파일은 압축을 풀었을 때 특정 이미징 방식을 사용하여 특정 시점에서 1,536웰 플레이트의 각 웰에서 얻은 이미지를 포함합니다.FileZilla 클라이언트 또는 기타 옵션을 사용하여 ftp 데이터에 액세스합니다.참고: FileZilla 클라이언트는 계산 충돌을 최소화하기 위해 대용량 파일 전송 볼륨을 관리하는 데 권장되는 방법입니다.FileZilla 클라이언트를 사용자 컴퓨터에 설치해야 하는 경우 FileZilla 소프트웨어를 다운로드합니다. FileZilla Client가 이미 설치되어 있거나 설치시 FileZilla 아이콘을 클릭하여 소프트웨어를 엽니 다. 호스트 ftp 웹 사이트, 사용자 이름 및 암호를 입력하여 FileZilla에서 원격 ftp 서버에 로그인합니다. 원하는 디렉토리에 .rar 파일을 다운로드합니다. AI 지원 오픈 소스 GUI를 사용하여 결정화 이미지를 보고, 점수를 매기고, 분석할 수 있습니다.참고: GUI는 대부분의 Windows, Mac 및 Linux 운영 체제(OS)에서 사용할 수 있으며 OS별 다운로드 지침은 GitHub 사이트에 있습니다. MARCO Polo는 HTX Center에서 구현된 고처리량 1,536 결정화 화면의 메타데이터를 통합하는 오픈 소스 GUI입니다. 누구나 GitHub에서 다운로드하여 다른 실험실 그룹의 특정 요구 사항을 반영하도록 수정할 수 있습니다.파일을 다운로드한 후 GUI에서 .rar 파일을 엽니다( 보충 그림 S1 참조).Import( 가져오기)를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Images(이미지 )를 선택한 다음 From Rar Archive/Directory(Rar 아카이브/디렉터리에서)를 선택합니다. 팝업 창에서 Browse for Folder(폴더 찾아보기 )를 클릭한 다음 이미지가 포함된 폴더로 이동합니다. 원하는 파일을 선택하고 열기를 클릭하여 GUI로 가져옵니다. 선택한 경로 창에 파일이 나타날 때까지 기다립니다. GUI에 다운로드할 파일을 하나 이상 선택하고 Import Runs(실행 가져오기)를 클릭합니다. 샘플 이름 왼쪽에 있는 > 기호를 클릭한 다음 두 번 클릭하여 적절한 읽기를 선택하여 GUI의 슬라이드쇼 뷰어 창에서 첫 번째 웰의 이미지를 봅니다(읽기는 이미지 명시야, UV-TPEF 또는 SHG의 날짜 및 유형별로 나열됨). 전체 창의 크기를 조정하여 이미지를 확대합니다. 이미지 세부 정보 상자에는 점수 매기기 정보(읽기가 채점될 때까지 비어 있음)를 포함하여 이미지에 대한 정보가 포함됩니다. 칵테일 세부 정보 상자에는 칵테일 구성 요소에 대한 메타데이터가 포함되어 있습니다. 탐색 패널에서 다음 버튼을 클릭하거나 키보드에서 오른쪽 화살표 키를 눌러 다음 웰로 이동합니다. 웰 번호별(By Well Number) 창에 웰 번호를 입력하여 특정 웰로 이동합니다. Show All Dates(모든 날짜 표시) 상자를 선택하여 GUI로 가져온 모든 읽기를 봅니다. Show All Spectra 상자를 선택하여 GUI로 가져온 모든 스펙트럼을 봅니다. 스펙트럼 스왑 버튼을 클릭하면 각 스펙트럼 이미지를 개별적으로 볼 수 있습니다. MARCO 알고리즘을 사용하여 먼저 창 왼쪽의 목록에서 특정 실행을 강조 표시하여 수정 이미지의 점수를 매깁니다. 그런 다음 선택한 실행 분류 버튼을 클릭합니다. 모든 1,536개의 웰에 대해 이미징 판독값이 점수가 매겨지면 이미지 세부 정보 창에서 MARCO 점수 정보를 봅니다.참고: 분류는 일반적으로 컴퓨터 속도와 사용 가능한 메모리에 따라 2-5분 정도 걸립니다. 이 알고리즘은 콘텐츠를 “crystal”, “clear”, “precipitate” 또는 “other” 클래스로 분류하는 점수를 생성합니다. 각 웰의 분류와 연관된 숫자 값은 해당 클래스의 오브젝트를 포함하는 웰의 가능성을 반영합니다.Image Filtering 패널에서 원하는 상자를 선택하고 Submit Filters 버튼을 클릭하여 점수가 매겨진 이미지의 하위 집합을 봅니다. 예를 들어, 크리스탈 및 MARCO 상자를 선택하고 필터 제출을 클릭하여 MARCO에서 크리스탈로 분류한 이미지만 볼 수 있습니다. 크리스탈 이미지를 수동으로 채점하여 “인간 점수” 세트를 생성합니다. 적절한 버튼을 클릭하여 우물에 점수를 할당합니다(“크리스탈”, “클리어”, “침전” 또는 “기타” 버튼은 창 하단의 분류 패널에 있음). 또는 키보드의 숫자 패드를 사용하여 점수를 할당합니다(1 = “crystal”, 2 = “clear”, 3 = “precipitate”, 4 = “other”). 즐겨찾기 를 선택하여 사람이 점수를 매긴 이미지를 “즐겨찾기”로 지정하시겠습니까?상자.참고: Crystals and the Human 상자를 선택하고 Submit Filters(필터 제출)를 클릭하여 인간이 크리스탈로 분류한 이미지만 봅니다. 필터링 패널에서 즐겨찾기 상자를 클릭하면 반환된 이미지의 범위가 더 좁혀지고 즐겨찾기이기도 한 사람이 점수를 매긴 크리스탈 이미지만 반환됩니다. 플레이트 뷰어 탭을 사용하여 한 번에 여러 웰을 볼 수 있습니다. 컨트롤 패널의 두 번째 플레이트 뷰어 탭에 있는 플레이트당 이미지 섹션의 드롭다운 메뉴에서 16개, 64개 또는 96개의 이미지를 선택합니다. 이미지 필터링 탭을 사용하여 관심 없는 이미지를 회색으로 표시합니다. 필터 적용 상자를 선택하여 이미지를 필터링합니다.참고: 예를 들어ample, “인간” 및 “수정” 상자를 선택하면 인간이 수정으로 채점한 우물만 쉽게 볼 수 있습니다.플레이트 뷰어 탭에서 다음 버튼을 클릭하여 다음 16/64/96 이미지 세트를 봅니다. 기본적으로 크리스탈로 점수가 매겨진 이미지는 빨간색, 투명으로 점수가 매겨진 이미지는 파란색, 침전물로 점수가 매겨진 이미지는 녹색, 다른 것으로 점수가 매겨진 이미지는 주황색입니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 색상을 변경합니다. 레이블 탭에서 다양한 상자를 선택하여 웰에 표시할 정보를 선택합니다. Save View(뷰 저장)를 클릭하여 현재 뷰의 이미지 파일을 저장합니다. 스펙트럼 스왑(Swap Spectrum)을 클릭하여 다중 웰 이미지에 대한 명시야, SHG 및 UV-TPEF 이미지 간에 전환합니다. 내보내기를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 적절한 파일 형식을 선택하여 다른 프로그램에서 사용할 수 있도록 점수가 매겨진 파일을 내보냅니다.참고: CSV(쉼표로 구분된 값) 파일은 Microsoft Excel 또는 Google 스프레드시트와 같은 스프레드시트 프로그램과 호환됩니다. JSON(JavaScript Object Notation) 파일은 대부분의 텍스트 편집기에서 열 수 있습니다. PPTX(PowerPoint 프레젠테이션)를 사용하여 명시야, UV-TPEF 및 SHG 이미지의 비교를 포함하여 Polo의 이미지를 표시할 수 있습니다. 파일은 MARCO Polo GUI에서 다시 열 수 있도록 .xtal 형식으로 저장됩니다.페이지 상단의 File(파일)을 클릭한 다음 Save Run(실행 저장) 또는 Save Run As(다른 이름으로 실행 저장)를 선택하여 .xtal 형식 파일을 저장합니다. 파일 이름 및 디렉터리 위치를 제공합니다. Import(가져오기)를 클릭하고 Images(이미지)를 선택한 다음 From Saved Run(저장된 실행에서)을 선택하여 .xtal 형식 파일을 엽니다. 적절한 파일 위치를 찾아 파일 이름을 클릭한 다음 열기를 클릭합니다.

Representative Results

1,536웰 크리스탈 스크리닝 실험의 결과는 0일(음성 대조군), 1일차, 1주차, 2주, 3주, 4주 및 6주에 수집된 7개의 완전한 명시야 이미지 세트로 구성됩니다(그림 4). SONICC 이미지는 23°C에서 배양한 플레이트의 경우 4주 시점에서, 4°C 또는 14°C에서 배양된 플레이트의 경우 6주 시점에 수집됩니다. 전체적으로 샘플이 배송되면 사용자는 도착 후 1일 이내에 플레이트를 설치할 것으로 예상할 수 있습니다. 이미지는 수집되는 대로 업로드됩니다. 결정화 스크리닝 실험은 6주 후에 종료됩니다. 1,536웰 플레이트 설정을 통해 모든 스크리닝 실험을 동일한 플레이트 내에서 수행할 수 있으므로 샘플 소비를 제한하고 이미징 및 이미징 방식 간의 직접적인 비교를 용이하게 합니다. 단일 칵테일 조건에 대한 결정 성장의 시간 경과에 대한 대표적인 결과는 도 4에 나타내었다. 실험 과정 전반에 걸친 자동 플레이트 이미징을 통해 명시야 이미징을 통해 빠르게 성장하는 결정과 천천히 성장하는 결정을 모두 식별할 수 있습니다. UV-TPEF 및 SHG 이미징을 사용하면 명시야 이미징으로 관찰된 히트의 교차 검증이 가능하며 관찰된 결정이 각각 단백질성 및 결정질임을 나타냅니다(그림 5A, B). 또한 SONICC 이미징을 통해 침전물이나 필름에 의해 시각적으로 가려진 결정(그림 5C) 또는 침전물로 오인될 수 있는 미세결정(그림 5D)을 식별할 수 있습니다. 일부 결정의 경우, SHG 신호의 부족은 도 5C의 정방정 타우마틴 결정에 의해 예시된 바와 같이, 일부 점 그룹이 SHG 신호(35,36)를 생성하지 않기 때문에 실격되지 않는다. 반대로, 트립토판 잔기가 부족한 단백질에 대한 UV-TPEF 신호의 부족이 예상되어야 합니다. 또한 UV-TPEF 및 SHG 신호의 관찰은 명시야에 나타나고 강한 양의 SHG 신호를 나타내지만 UV-TPEF 신호가 없는 비단백질 염 결정의 식별을 용이하게 합니다(그림 5E). 플레이트 설정을 위한 이미지 분석은 HWI 서버에서 ftp 데이터 전송을 번들로 제공하는 MARCO Polo GUI를 통해 간소화됩니다(FileZilla로 파일을 전송하는 대신 사용). MARCO Polo GUI를 사용하면 플레이트 및 이미지를 쉽게 탐색할 수 있으며 MARCO 알고리즘을 사용하여 계산 이미지 스코어링을 수행하므로 HTX 센터에서 이미지 결과를 빠르게 다운로드, 확인 및 분석할 수 있습니다. MARCO Polo GUI에 구현된 MARCO 스코어링 알고리즘은 5분 이내에 전체 1,536웰 플레이트의 이미지를 스코어링할 수 있습니다. MARCO 알고리즘에 의해 결정질로 표시된 이미지는 Polo GUI에 의해 정렬되어 표시될 수 있습니다. MARCO 알고리즘은 긍정 적중을 놓치지 않도록 결정 식별 및 거짓 음성을 최소화하는 데 최적화되어 있기 때문에 점수 매기기로 인해 거짓 양성 플래그가 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, MARCO가 결정을 함유할 가능성이 높은 웰에 주의를 집중시킴으로써 검사할 필요가 있는 이미지 세트를 제한하는 능력은 사용자의 데이터 처리 부담을 상당히 감소시킨다. MARCO 점수를 기반으로 이미지를 정렬할 수 있는 기능을 갖춘 사용자 친화적인 MARCO Polo 보기 플랫폼에서 알고리즘을 편리하게 구현하면 데이터 세트를 신속하게 분석하고 수정 히트를 정확하게 결정할 수 있는 사용자의 능력이 크게 향상됩니다. 그림 1: HTX 센터에서 수행된 고처리량 1,536웰 결정화 스크리닝 실험의 개략도. (1) 이 단계에서, 5 μL의 파라핀 오일과 200 nL의 칵테일을 각 웰에 첨가한다 (프로토콜 단계 3.1 및 단계 3.5). 기름과 칵테일만 들어 있는 하나의 우물에 대한 만화 삽화와 대표 이미지가 오른쪽에 표시됩니다. (2) 샘플은 HTX 센터에 도착합니다(프로토콜 단계 5.1). 3) 이 단계에서, 200 nL의 샘플이 각 웰에 첨가된다(프로토콜 단계 5.4). (4) 모든 1,536개의 웰은 명시야 이미징, 5) UV-TPEF 및 SHG 방식(프로토콜 단계 6)을 사용하여 시간이 지남에 따라 모니터링됩니다. 6) AI 지원 오픈 소스 GUI는 결정화 이미지를 보고, 점수를 매기고, 분석하는 데 사용됩니다(프로토콜 단계 7). 약어: HTX = 고처리량 결정화; UV-TPEF = UV-이광자 여기 형광; SHG = 2차 고조파 생성; AI = 인공 지능; GUI = 그래픽 사용자 인터페이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 명시야, UV-TPEF 및 SHG 이미징을 사용하여 이미지화한 스크리닝 실험이 포함된 단일 1,536웰 플레이트. 1,536웰 플레이트는 눈금에 대한 미국 페니로 표시됩니다(위). 각 스크리닝 실험은 명시야 이미징을 사용하여 설정 전 한 번, 샘플 추가 후 6번 이미지화됩니다(총 7개의 명시야 이미지 세트, 왼쪽). 플레이트는 4주 또는 6주에 UV-TPEF(중앙) 및 SHG(오른쪽) 이미징을 거칩니다. 약어: UV-TPEF = UV-2광자 여기 형광; SHG = 2차 고조파 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 1,536웰 플레이트가 어떻게 생성되는지 보여주는 개략도. 16개의 96웰 DW 블록을 사용하여 4개의 384웰 플레이트를 스탬핑하고, 각 384웰 플레이트의 각 사분면은 결정화 칵테일을 분배하여 채워집니다. 4개의 96웰 DW 블록이 하나의 384웰 플레이트(가운데)를 채웁니다. 4개의 384웰 플레이트를 사용하여 단일 1,536웰 플레이트를 스탬핑합니다(오른쪽). 약어: DW = 깊은 우물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 1,536-웰 스크리닝 실험에서 단일 웰의 대표적인 시간 경과. 플레이트는 샘플 설정(0일) 전에 이미지화되고 1일차, 1주차, 2주차, 3주, 4주, 6주에 명시야 이미징으로 이미징됩니다. 23°C에서 배양된 플레이트는 4주차에 SONICC로 이미지화됩니다. 스케일 바 = 80 μm (명시야), 200 μm (SHG, UV-TPEF). 약어: SONICC = 키랄 결정의 2차 비선형 이미징; UV-TPEF = UV-이광자 여기 형광; SHG = 2차 고조파 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: HT 1,536 크리스탈 스크리닝 실험에 대한 대표적인 이미징 결과. 명시야, UV-TPEF 및 SHG 이미징 결과는 5개의 예시 웰에 대해 표시됩니다. (ᄀ,ᄂ) 명시야, UV-TPEF 및 SHG 이미징으로 관찰된 단백질 결정은 세 가지 이미징 방식 모두에서 명확하게 드러납니다. (C) 명시야 이미징에서 필름으로 가려진 단백질 결정은 UV-TPEF 이미징으로 볼 수 있습니다. 결정은 점 그룹 비호환성으로 인해 SHG 이미징으로 관찰되지 않습니다. (D) 침전물로 간주될 수 있는 UV-TPEF 및 SHG 이미징으로 확인된 미세 결정의 예. (E) 명시야 및 SHG 이미징에 의해 결정질로 나타나지만 UV-TPEF 신호를 나타내지 않는 염 결정의 예. 스케일 바 = 200 μm. 우물 직경 = 0.9 mm. 약어: UV-TPEF = UV-2광자 여기 형광; SHG = 2차 고조파 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 그림 S1: MARCO Polo에서 이미지 파일 열기. 이미지 파일은 MARCO Polo GUI 내에서 가져오기 |상단의 이미지 탭(a). 파일은 MARCO Polo(a)에서 직접 FTP에서 도구를 통해 전송하거나 프로토콜 단계 7.2에 설명된 대로 FileZilla를 통해 전송할 수도 있습니다. 이미 다운로드한 파일을 가져오려면 이미지 | rar archive/directory에서. 팝업 창이 나타나면 폴더 찾아보기(b)를 선택하고 플레이트 이미지 파일이 저장된 파일 디렉토리로 이동합니다. 파일이 선택한 경로 창(c)에 있으면 파일을 강조 표시하고 가져오기 실행(d)을 클릭합니다. MARCO Polo GUI는 이미지와 함께 가져올 올바른 칵테일 파일 메타데이터를 식별합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 방법은 마이크로 배치-언더-오일 형식에서 1,536개의 개별 결정화 실험에 500μL의 샘플만 필요한 단백질 결정화 스크리닝을 위한 고처리량 파이프라인을 설명합니다. 파이프라인은 액체 처리 로봇을 사용하여 실험 설정을 빠르고 재현 가능하게 지원하며, MARCO 알고리즘을 사용하여 1,536웰 플레이트 이미지를 분석하여 결정 히트를 식별하고 분리하도록 맞춤화된 전산 이미지 분석 리소스인 MARCO Polo에 의존합니다.

소량의 개별 스크리닝 방울(총 400nL, 샘플:칵테일 비율 1:1)은 양성 결정화 조건을 식별하기 위해 매우 적은 양의 샘플이 필요하다는 것을 의미합니다. 이러한 작은 방울 크기는 필연적으로 전통적인 루핑으로 낚시할 수 없는 작은 결정을 생성합니다. 1,536개의 판에서 수확하는 방법이 개발되었다^.37; 추가적으로, 결정이 있는 플레이트는 현장 데이터 수집³⁸을 위해 싱크로트론 소스에서 직접 사용되었습니다. 이러한 결정을 수확하기 위한 강력한 방법이 개발되면 싱크로트론 기술과 마이크로 포커스 빔의 발전으로 유용한 데이터 세트를 더욱 얻을 수 있을 것입니다. 또한 얻은 결정은 잠재적으로 최적화 노력의 씨앗으로 사용될 수 있습니다.

SONICC 이미징은 작은 단백질 결정과 침전물 아래에 숨겨진 단백질 결정을 모두 식별하는 데 분명히 유리합니다. 이러한 장점에도 불구하고 모든 시료 유형이 SHG 및 UV-TPEF 이미징에 적합한 것은 아닙니다. 예를 들어, 방향족 트립토판 잔기가 거의 또는 전혀 없는 단백질은 모호한 UV-TPEF 신호를 나타냅니다. 또한, 중심 대칭 그룹 또는 점 그룹(432)을 포함하는 특정 공간 그룹의 결정은 SHG 이미징에 의해 검출되지 않을 것이다. 형광단이 있는 샘플은 때때로 SHG 신호를 방해하여 신호를 상쇄하거나 강도를 증가시키는데, 이는 금속 함유 단백질 및 형광 모이어티를 포함하는 단백질에 대해 SHG 신호의 신중한 해석이 필요함을 의미합니다. 그러나 많은 경우 SHG 또는 UV-TPEF 신호의 부재를 합리화할 수 있으며 이러한 신호의 부족이 반드시 단백질 결정의 존재를 배제해서는 안 됩니다.

microbatch-under-oil 형식은 고처리량 결정학에 사용되는 보다 일반적인 증기 확산 방법에 대한 대안을 제공합니다. 중요하게도, 결정화 포맷은 히트 식별⁽³⁹)에 영향을 미치며, 이는 고처리량 스크리닝 노력을 위해 상이한 결정화 포맷을 사용하기 위한 이론적 근거를 제공한다. 자동 이미징 및 SONICC 지원 양식은 6주간의 실험 기간 동안 단백질 결정을 신속하게 식별하는 데 도움이 됩니다. 마지막으로, MARCO Polo GUI를 통해 사용자는 1,536개 조건의 이미지를 신속하게 분석하여 최적화를 위한 유망한 히트 웰을 식별할 수 있습니다. 로봇 공학을 지원하는 고처리량 실험 설정과 분석을 위한 최첨단 이미징 및 계산 도구를 포함한 HTX 센터의 기능은 연구원들이 결정 기반 구조 작업의 주요 병목 현상인 결정화 조건을 찾는 데 효과적으로 대처할 수 있도록 지원함으로써 구조 생물학 커뮤니티에 큰 기여를 합니다.

Materials

1536 Well Imp@ct LBR LoBase	Greiner Bio-One	790 801
Acetic acid	Hampton Research	HR2-853
AlumaSeal II Sealing Film	Hampton Research	HR8-069
Ammonium bromide	Molecular Dimensions	MD2-100-247
Ammonium chloride	Hampton Research	HR2-691
Ammonium hydroxide	Hampton Research	HR2-855
Ammonium nitrate	Hampton Research	HR2-665
Ammonium phosphate dibasic	Hampton Research	HR2-629
Ammonium phosphate monobasic	Hampton Research	HR2-555
Ammonium sulfate	Hampton Research	HR2-541
Ammonium thiocyanate	Molecular Dimensions	MD2-100-301
Bicine pH 9.0	Hampton Research	HR2-723
Bis-tris propane pH 7.0	Hampton Research	HR2-993-08
Calcium acetate	Hampton Research	HR2-567
Calcium chloride dihydrate	Hampton Research	HR2-557
CAPS pH 10.0	Rigaku Reagents	none given
ClearSeal Film	Hampton Research	HR4-521
Cobalt sulfate heptahydrate	Molecular Dimensions	MD2-100-42
Crystal Screen HT screen	Hampton Research	HR2-130
Formulator	Formulatrix
Glycerol	Hampton Research	HR2-623
Gryphon liquid handling robot	Art Robbins Instruments
HEPES pH 7.0	Hampton Research	HR2-902-03
HEPES pH 7.5	Hampton Research	HR2-902-08
HWI HTX Center sample submission form			https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/
Hydrochloric acid	Hampton Research	HR2-581
Index HT screen	Hampton Research	HR2-134
Ionic Liquid screen	Hampton Research	HR2-214
Lithium bromide	Molecular Dimensions	MD2-100-312
Lithium chloride	Hampton Research	HR2-631
Lithium sulfate monohydrate	Hampton Research	HR2-545
Magnesium acetate tetrahydrate	Hampton Research	HR2-561
Magnesium chloride hexahydrate	Hampton Research	HR2-559
Magnesium nitrate hexahydrate	Hampton Research	HR2-657
Magnesium sulfate heptahydrate	Hampton Research	HR2-821
Manganese chloride tetrahydrate	Millipore Sigma	63535-50G
Manganese sulfate monohydrate	Molecular Dimensions	MD2-100-310
MARCO Polo GUI download			https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/
Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot	Thermo Scientific
MES pH 6.0	Hampton Research	HR2-943-09
Mosquito liquid handling robot	SPTLabtech
Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F	Sigma Aldrich	PX0045-3
PEG 1000	Hampton Research	HR2-523
PEG 2000	Hampton Research	HR2-592
PEG 20000	Hampton Research	HR2-609
PEG 3350	Hampton Research	HR2-527
PEG 400	Hampton Research	HR2-603
PEG 4000	Hampton Research	HR2-529
PEG 6000	Hampton Research	HR2-533
PEG 8000	Hampton Research	HR2-535
PEG/Ion HT screen	Hampton Research	HR2-139
PEGRx HT screen	Hampton Research	HR2-086
Plate reservations			htslab@hwi.buffalo.edu
Potassium acetate	Hampton Research	HR2-671
Potassium bromide	Hampton Research	HR2-779
Potassium carbonate	Molecular Dimensions	MD2-100-311
Potassium chloride	Hampton Research	HR2-649
Potassium nitrate	Hampton Research	HR2-663
Potassium phosphate dibasic	Hampton Research	HR2-635
Potassium phosphate-monobasic	Hampton Research	HR2-553
Potassium phosphate-tribasic	Molecular Dimensions	MD2-100-309
Potassium thiocyanate	Hampton Research	HR2-695
Rock Imager 1000 with SONICC	Formulatrix
Rock Imager 54	Formulatrix
Rubidium chloride	Millipore Sigma	R2252-10G
SaltRx HT screen	Hampton Research	HR2-136
Silver Bullets screen	Hampton Research	HR2-096
Slice pH screen	Hampton Research	HR2-070
Sodium acetate pH 5.0	Hampton Research	HR2-933-15
Sodium bromide	Hampton Research	HR2-699
Sodium chloride	Hampton Research	HR2-637
Sodium citrate pH 4.2	Hampton Research	HR2-935-01
Sodium citrate pH 5.6	Hampton Research	HR2-735
Sodium hydroxide	Hampton Research	HR2-583
Sodium molybdate dihydrate	Molecular Dimensions	MD2-100-207
Sodium nitrate	Hampton Research	HR2-661
Sodium phosphate monobasic	Hampton Research	HR2-551
Sodium thiosulfate pentahydrate	Molecular Dimensions	MD-100-307
StockOptions Polymer screen	Hampton Research	HR2-227
Tacsimate pH 7	Hampton Research	HR2-755
TAPS pH 9.0	bioWORLD	40121071
Tris pH 8	Hampton Research	HR2-900-11
Tris pH 8.5	Hampton Research	HR2-725
ViaFLO 384	Integra
ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL)	Integra
ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL)	Integra
Zinc acetate dihydrate	Hampton Research	HR2-563