Høy gjennomstrømningsscreening for å oppnå krystalltreff for proteinkrystallografi

Summary

Denne protokollen beskriver høy gjennomstrømningskrystallisasjonsscreening, alt fra 1,536 mikroanalyseplatepreparatet til slutten av et 6 ukers eksperimentelt tidsvindu. Detaljer er inkludert om prøveoppsettet, avbildningen som er oppnådd, og hvordan brukere kan utføre analyser ved hjelp av et grafisk brukergrensesnitt som er aktivert for kunstig intelligens for raskt og effektivt å identifisere makromolekylære krystallisasjonsbetingelser.

Abstract

Røntgenkrystallografi er den mest brukte teknikken for å skille makromolekylære strukturer, men det avgjørende trinnet for å krystallisere et protein til et bestilt gitter som er egnet til diffraksjon, er fortsatt utfordrende. Krystalliseringen av biomolekyler er i stor grad eksperimentelt definert, og denne prosessen kan være arbeidskrevende og uoverkommelig for forskere ved ressursbegrensede institusjoner. Ved National High-Throughput Crystallization (HTX) Center har svært reproduserbare metoder blitt implementert for å lette krystallvekst, inkludert et automatisert 1,536-brønns mikrobatch-under-oljeplateoppsett med høy gjennomstrømning designet for å prøve en bred bredde av krystallisasjonsparametere. Plater overvåkes ved hjelp av toppmoderne bildebehandlingsmodaliteter i løpet av 6 uker for å gi innsikt i krystallvekst, samt å nøyaktig skille verdifulle krystalltreff. Videre effektiviserer implementeringen av en trent kunstig intelligens-scoringsalgoritme for å identifisere krystalltreff, kombinert med et åpen kildekode, brukervennlig grensesnitt for visning av eksperimentelle bilder, prosessen med å analysere krystallvekstbilder. Her beskrives de viktigste prosedyrene og instrumenteringen for fremstilling av cocktailer og krystallisasjonsplater, avbildning av platene og identifisering av treff på en måte som sikrer reproduserbarhet og øker sannsynligheten for vellykket krystallisering.

Introduction

Selv i en alder av enorme fremskritt i strukturelle biologiske metoder, fortsetter røntgenkrystallografi å være en pålitelig og populær metode for å generere høykvalitets strukturelle modeller av makromolekyler. Over 85% av alle tredimensjonale strukturelle modeller deponert til Protein Data Bank (PDB) er fra krystallbaserte strukturelle metoder (per januar 2023). ¹ Videre er røntgenkrystallografi fortsatt uunnværlig for å løse proteinligandstrukturer, en avgjørende komponent i legemiddeloppdagelses- og utviklingsprosessen². Til tross for at proteinkrystallisering har vært den dominerende strukturbiologiske teknikken i over et halvt århundre, er metoder for å forutsi krystallisasjonssannsynlighet basert på fysiske egenskaper³ eller sekvens ^4,5 fortsatt i sin barndom.

Prediksjonen av krystallisasjonsbetingelser er enda mer uklar; Det er gjort begrensede fremskritt for å forutsi sannsynlige krystallisasjonsbetingelser selv for modellproteiner ^6,7. Andre studier har forsøkt å identifisere krystallisasjonsbetingelser basert på proteinhomologi og forhold utvunnet fra PDB ^8,9,10. Den prediktive kraften som finnes i PDB er imidlertid begrenset, da bare de endelige, vellykkede krystallisasjonsbetingelsene blir avsatt, noe som nødvendigvis savner de ofte omfattende optimaliseringseksperimentene som kreves for å finjustere krystallveksten. Videre mangler mange PDB-oppføringer metadata som inneholder disse detaljene, inkludert cocktailformlene, krystallisasjonsformatet, temperaturen og tiden for å krystallisere^11,12. Derfor, for mange proteiner av interesse, er den mest tilgjengelige måten å bestemme krystallisasjonsbetingelsene eksperimentelt, ved å bruke så mange forhold som mulig over et bredt spekter av kjemiske muligheter.

Flere tilnærminger for å gjøre krystallisasjonsscreening så fruktbar og grundig som mulig har blitt utforsket med stor effekt, inkludert sparsomme matriser 13, ufullstendig faktoriell screening 14, tilsetningsstoffer 15,16^, såing 17 og nukleasjonsmidler ¹⁸. National HTX Center ved Hauptman-Woodward Medical Research Institute (HWI) har utviklet en effektiv rørledning for krystallisasjonsscreening ved hjelp av mikrobatch-under-olje-tilnærmingen¹⁹, som benytter automatisert væskehåndtering og bildebehandlingsmodaliteter for å strømlinjeforme identifiseringen av innledende krystallisasjonsbetingelser ved bruk av relativt minimale prøve- og cocktailvolumer (figur 1). Settet med 1,536 unike cocktailer er basert på forhold som tidligere er bestemt å bidra til proteinkrystallvekst og er designet for å være kjemisk mangfoldig for å prøve et stort utvalg av mulige krystallisasjonsbetingelser^20,21,22. Den brede prøvetaking av krystallisasjonsbetingelser øker sannsynligheten for å observere en eller flere krystallisasjonsledninger.

Det har fremkommet få formelle analyser av hvor mange tilstander som skal til for screening i litteraturen. En studie fokuserte på prøvetakingsoppsettet til forskjellige skjermer og fant at tilfeldig prøvetaking av komponenter (lik en ufullstendig faktoriell) representerte den mest grundige og effektive prøvetakingsmetoden²³. En annen studie av screening bemerket at det har vært mange tilfeller når den svært grundige 1,536-skjermen bare har gitt en enkelt krystalltreff²⁴, og en veldig nylig studie fremhevet at de fleste kommersielle skjermer undersampler krystallisasjonsrommet som er kjent for å være assosiert med screeningtreff²⁵. Ikke alle krystallisasjonsledninger vil gi en krystall med diffraksjonskvalitet som er egnet for datainnsamling på grunn av iboende uorden i krystallet, diffraksjonsbegrensninger eller krystallfeil; Derfor har støping av et bredere nett for forhold den ekstra fordelen av å gi alternative krystallformer for optimalisering.

Formatet på proteinkrystallisasjonseksperimenter har også innvirkning på skjermens suksess. Dampdiffusjon er det mest brukte oppsettet for krystallisasjonsapplikasjoner med høy gjennomstrømning og brukes på toppmoderne krystallisasjonssentre, inkludert EMBL Hamburg og Institut Pasteur high-throughput screening sentre^26,27,28. HTX-senteret bruker mikrobatch-under-olje-metoden; Selv om det er mindre vanlig, er det en robust metode som minimerer forbruket av prøve- og krystalliseringscocktailer^20,21,22. En fordel med mikrobatch-under-olje-metoden, spesielt ved bruk av parafinolje med høy viskositet, er at bare liten fordampning skjer i dråpen under forsøket, noe som betyr at likevektskonsentrasjonen oppnås ved dråpeblanding. Hvis positive krystallisasjonsresultater observeres i mikrobatch-under-olje-metoden, er reproduksjonen av disse forholdene vanligvis enklere enn i dampdiffusjonsoppsett, hvor krystallisering skjer på et udefinert punkt under likevekten mellom krystallisasjonsfallet og reservoaret. Reproduserbarheten av treff er ønskelig for krystalliseringsmetoder med høy gjennomstrømning, som produserer uoverkommelig små proteinkrystaller som vanligvis må optimaliseres for enkeltkrystallrøntgeneksperimenter.

Krystallisasjonsskjermen med høy gjennomstrømning for løselige proteiner består av cocktailer som tilberedes internt, ferdige kommersielle skjermer og internt modifiserte kommersielle skjermer²². Cocktailene ble opprinnelig utviklet ved hjelp av den ufullstendige faktorielle strategien ved bruk av tidligere vellykkede krystallisasjonscocktailer²⁰. Reagensene i skjermen som er kommersielt tilgjengelige, inkluderer arrays av polymerer, krystallisasjonssalter, PEG og ionkombinasjoner og skjermer som bruker sparsom matrise og ufullstendige faktorielle tilnærminger. Det er også reagenser som modifiseres før inkludering i skjermen: en additiv skjerm, en pH- og bufferskjerm, en ionisk flytende additivskjerm og en polymerskjerm.

Kraften til kjente krystallisasjonsbetingelser og strategier har blitt utnyttet i 1,536 krystallisasjonscocktailer, sammen med fordelene med mikrobatch-under-olje-systemet for å generere en rørledning som benytter automatisert væskehåndtering, automatisert lysfeltavbildning og andreordens ikke-lineær avbildning av kirale krystaller (SONICC). Automatiseringen av både væskehåndtering og avbildning gir fordelene med færre våte laboratorietimer og høyere reproduserbarhet. Den høye gjennomstrømningen av automatisert krystallisasjonsscreening nødvendiggjør automatisering av prosessen med overvåking for krystallvekst. Disse fremskrittene oppnås med toppmoderne bildebehandlingsteknologier for å hjelpe til med identifisering av positive krystalltreff. Både standard lysfeltavbildning av plater, samt flerfotonmetoder for forbedret deteksjon, brukes via et krystallavbildningssystem med SONICC (figur 2). SONICC kombinerer andre harmoniske generasjon (SHG)²⁹ mikroskopi og ultrafiolett to-foton eksitert fluorescens (UV-TPEF)³⁰ mikroskopi for å oppdage svært små krystaller, så vel som de som er skjult av bunnfall. SONICC-avbildningen informerer om brønnene inneholder protein (via UV-TPEF) og krystaller (via SHG). Utover den positive identifiseringen av proteinkrystaller, kan ytterligere informasjon også fås ved hjelp av toppmoderne bildebehandlingsmetoder. Cocktail-only imaging før prøvetilsetning fungerer som en negativ kontroll; Disse bildene kan identifisere brønnutseendet før prøvetilsetning, inkludert når det gjelder saltkrystaller og rusk. I tillegg hjelper SHG og UV-TPEF-avbildning med å skille proteinkrystaller fra saltkrystaller og kan brukes til å visualisere protein-nukleinsyrekomplekst materiale³¹.

Krystallisasjonseksperimenter med høy gjennomstrømning som gjennomgår gjentatt overvåking via avbildning, resulterer i et meget stort volum bilder som trenger undersøkelse. Automatiserte krystallscoringsmetoder er utviklet for å redusere belastningen på brukeren og øke sannsynligheten for å identifisere positive krystalltreff. HTX-senteret deltok i utviklingen av MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO) scoring algoritme, en trent dyp konvolusjonell nevral nettverksarkitektur utviklet av et konsortium av akademiske, ideelle, myndigheter og industripartnere for å klassifisere brightfield-brønnbilder³². Algoritmen ble trent på nesten en halv million lysfeltbilder fra krystallisasjonseksperimenter fra flere institusjoner ved hjelp av forskjellige krystallisasjonsmetoder og forskjellige bilder. Algoritmen gir en probabilistisk poengsum som indikerer om et gitt bilde faller inn i fire mulige bildeklasser: “krystall”, “klar”, “utfelling” og “annet”. MARCO har en rapportert klassifiseringsnøyaktighet på 94,5 %. Krystalldeteksjon er ytterligere forbedret med programvare som implementerer algoritmen og gir et grafisk brukergrensesnitt (GUI) for tilgjengelig og enkel bildevisning, aktivert med AI-aktiverte poengfunksjoner^32,33. MARCO Polo GUI er designet for å fungere sømløst med oppsettet av bildebehandlings- og datastyringssystemet i HTX-senteret for å identifisere treff i 1,536-brønnsskjermen, med menneskelig engasjement for å undersøke utdataene fra sorterte lister. I tillegg, som åpen kildekode-programvare tilgjengelig på GitHub, er GUI lett tilgjengelig for modifikasjon for å gjenspeile de spesifikke behovene til andre laboratoriegrupper.

Her beskrives prosessen med å sette opp et mikrobatch-under-olje-eksperiment med høy gjennomstrømning ved hjelp av robotisk væskehåndtering for å levere både cocktailen og proteinet. HTX-senteret har et unikt utvalg av instrumentering og ressurser som ikke finnes ved andre institusjoner, med mål om å tilby screeningtjenester og pedagogiske ressurser til interesserte brukere. Å demonstrere metodene og egenskapene til robotikkaktiverte teknikker med høy gjennomstrømning vil gjøre det mulig for samfunnet å ha kunnskap om tilgjengelige teknologier og ta beslutninger for sin egen strukturbestemmelse.

Protocol

1. Tilberedning eller kjøp av cocktailer for seksten 96-brønns dype brønnblokker Forbered egengenererte kjemiske cocktailer ved å dispensere i 96-brønns dype brønnblokker (DW). Bruk en robotisk væskebehandler til å dispensere og blande stamløsninger av salter, buffere, polymerer og vann. Forbered internmodifiserte kjemiske cocktailer ved å bruke en robotisk væskebehandler eller flerkanals pipette for å legge til ekstra komponenter til 96-brønns DW-blokkskjermer som er kommersielt kjøpt. Kjøp kommersielt tilgjengelige DW-blokker. Oppbevares merkede 96-brønns DW-blokker ved -20 °C i 12-18 måneder.MERK: Cocktailene tilberedt i trinn 1.1. og 1.2. fylle 10/16 96-brønns DW-blokker, og 5/16 96-brønns DW-blokker brukes som kjøpt. En 96-brønns DW-blokk i skjermen er satt opp på tidspunktet for 1,536-brønns platedispensering for å unngå utfelling av additivskjermen (se avsnitt 3). 2. Utlevering av cocktailer til 384-brønnplater Tine 96-brønns DW-blokkene ved 4 °C over natten. Bring til romtemperatur (20-23 °C) før du begynner tilberedningen av platene i 384 brønner.NOTAT: Romtemperatur er egnet for tilberedning av cocktailplatene. Hovedproblemet ved å tilberede disse platene er å unngå utfellinger, noe som kan tette væskehåndteringsanordninger og føre til uforutsigbare endringer i konsentrasjonene av cocktailingrediensene. Bland blokkene grundig ved inversjon etter behov for å løse opp vedvarende ugjennomsiktig bunnfall. Hvis noen brønner inneholder bunnfall, varm blokkene til 30 °C for å løse opp. Lever 50 μL cocktailløsning fra fire 96-brønns DW-blokker til en 384-brønns plate ved hjelp av en væskehåndteringsrobot utstyrt med en 96 sprøyte eller pipettorhode. De fire 96-brønns DW-blokkene er stemplet ut i 384-brønnplaten slik at kvadranter fylles (f.eks. A1 på 96-DW1 til A1 på 384-plate1, A1 av 96-DW2 til B1 på 384-plate1, etc.) (Figur 3). Lever 15 av de 16 96-brønns DW-blokkene til 384-brønnsplater for lagring. Oppbevar platene med 384 brønner ved -20 °C i opptil 6 måneder for bruk ved tilberedning av platene med 1 536 brønner. 3. Klargjøre 1,536-brønnplatene med olje og krystalliseringscocktailer Lever 5 μL parafinolje til hver brønn i en 1,536-brønnplate ved hjelp av et robotisk væskehåndteringssystem med kapasitet til langsom aspirasjon og levering. Oppbevar oljeplatene ved 4 °C i opptil 6 måneder. Tine platene med 384 brønner fra seksjon 2 ved 4 °C over natten. Inverter platene for å blande løsningene og oppløs bunnfallet. Inkuber platene ved 30 °C for å løse opp vedvarende bunnfall. For å klargjøre de additive skjermkomponentene, bruk den endelige 96-brønns DW-blokken som inneholder 0,1 M HEPES pH 6,8, 30% PEG3350 for å blande med den kommersielle additivskjermen ved å bruke enten en væskehåndteringsrobot eller en flerkanalspipett. Forbered additive skjermløsninger ved å dispensere en 1: 1-blanding av den bufrede PEG3350-løsningen fremstilt i trinn 3.3 og additivskjermen til et endelig volum på 50 μL i den aktuelle 384-brønnplaten. Bruk en væskehåndteringsrobot utstyrt med en 384 sprøyte eller pipettorhode for å levere 200 nL cocktailløsning i hver brønn på 1,536-brønnplaten. Stemple ut fire 384-brønnplater i 1,536-brønnplaten slik at kvadranter fylles (f.eks. A1 av 384-plate1 til A1 av 1,536-brønnplaten, A2 av 384-plate1 til A3 av 1,536-brønnplaten, etc.) (Figur 3). Sentrifuger platene ved 150 × g i 5 minutter før oppbevaring ved 4 °C i opptil 4 uker. 4. Eksempel på innlevering For å sende inn en prøve, send en reservasjons-e-post før reservasjonsfristen for den kommende visningskjøringen. Inkluder antall screeningeksperimenter, navnet, PI og institusjonen, samt eventuelle spesielle håndteringskrav for prøven. Screeningkjøringer gjennomføres omtrent en gang i måneden, noe som resulterer i 12 kjøringer årlig. Fyll ut et eksempel på innsendingsskjema før du sender prøven.For nye brukere, velg et passord som skal brukes til å laste ned krystallisasjonsbildene i seksjon 7. For etablerte brukere, bruk et eksisterende passord eller endre passordet på dette trinnet. Send prøven i et 1,5 ml rør. Sørg for at makromolekylet er homogent og tilstrekkelig konsentrert for å fremme krystallisering. Bruk en prekrystallisasjonstest, vanligvis sammensatt av ammoniumsulfat eller PEG 4000, for å undersøke riktig prøvekonsentrasjon ved å observere om de testede prøvekonsentrasjonene resulterer i klare dråper eller utfelling34.MERK: Egnede kvalitetstester som kan utføres før prøveinnsending for å kontrollere renhet og homogenitet, inkluderer SDS-PAGE, gelfiltrering og dynamisk lysspredning (DLS), blant andre. Krystallisering kan påvirkes av tilstedeværelsen av enda mindre urenheter. Et prøvevolum på 500 μL er for tiden nødvendig for å sette opp en 1,536-brønnplate. Testing pågår for å redusere kravet til prøvevolum.Unngå å bruke bufferkonsentrasjoner større enn 50 mM, samt fosfater, som kan krystallisere i skjermen. Unngå overdreven oppløselige midler, inkludert glyserolkonsentrasjoner større enn 10% w / v. Pakk prøven for å opprettholde en passende temperatur trygt ved hjelp av tørris, våtis eller kjølepakker i en lukket beholder. Send prøveprioritet over natten på en mandag-onsdag under løpet. Send sporingsnummeret via e-post når prøven er sendt. 5. Prøveoppsett i de forberedte 1.536-brønnplatene Pakk ut prøver og inkuber umiddelbart ved temperaturen brukeren har bedt om. Når den er tint, sentrifuger prøven ved 10 000 × g i 2 minutter ved romtemperatur. Observer prøven visuelt for å identifisere nedbør, farge og tilstand for prøven før oppsett. Varm plate med 1 536 brønner til 23 °C og sentrifuge ved 150 × g i 5 minutter. Avbilde tallerkenen med ren cocktail ved hjelp av brightfield-avbildning som en negativ kontroll.MERK: Alle plater er avbildet med brightfield-avbildning før prøveoppsett, noe som gjør det mulig å identifisere brønner som allerede har krystaller eller rusk i dem før prøvetilsetning som en negativ kontroll. Videre muliggjør det identifisering av brønner der krystallisasjonscocktailen ikke er levert. Oppvarming av platen til romtemperatur eliminerer kondens på plateoverflaten, noe som fører til klare bilder. Dispenser 200 nL prøve til hver brønn i 1.536-brønnplaten ved hjelp av en væskehåndteringsrobot. Sentrifugeplate ved 150 × g og inkubasjonsplater ved 4 °C, 14 °C eller 23 °C.MERK: Microbatch under-olje-eksperimenter kan settes opp for hånd ved å dispensere protein og cocktail under ønsket olje. Det anbefales imidlertid å bruke ikke mindre enn 1 μL av hvert protein og cocktail for å oppnå reproduserbare resultater. 6. Overvåk 1,536-brønnplater for krystalldannelse Etter at prøven er lagt til 1 536-brønnplatene, bilde med brightfield-avbildning på dag 1 og uke 1, uke 2, uke 3, uke 4 og uke 6. Utføre SONICC-avbildning med SHG og UV-TPEF ved 4 ukers tidspunkt for inkuberte plater ved 23 °C og ved 6 ukers tidspunkt for inkuberte plater ved 14 °C eller 4 °C.MERK: Tidspunktet for SONICC-avbildningen er planlagt til 4 ukers og 6 ukers tidspunkter for 1,536 mikroassay-platen med høy gjennomstrømning fordi krystaller vanligvis vil vises ved disse tidspunktene. For modifisering av en 96-brønns mikrobatch under olje- eller dampdiffusjonseksperimenter, anbefales det å utføre SONICC-avbildningen tidligere i tidsvinduet. Få tilgang til eksperimentelle bilder som automatisk er overført til brukerkontoen ved hjelp av et internt LIMS-system. Varsle brukerne via en automatisk htslab-e-postdemon om at avbildning har skjedd. 7. Bildeanalyse Hent screeningbildene fra HWI ftp-nettstedet for hver .rar-fil.MERK: Bildeutgangen fra 1 536-skjermen resulterer i en rekke filer som inneholder lysfeltbilder, SHG-bilder og UV-TPEF-bilder. Hver avbildningsmodalitet eller tidspunkt er en egen .rar-fil. Hver .rar fil, når den pakkes ut, inneholder et bilde fra hver brønn på 1,536-brønnplaten på et bestemt tidspunkt ved hjelp av en spesifikk bildemodalitet.Bruk FileZilla-klienten eller andre alternativer for å få tilgang til ftp-dataene.MERK: FileZilla-klienten er den anbefalte måten å administrere det store filoverføringsvolumet for å minimere beregningskrasj.Hvis FileZilla Client må installeres på brukerdatamaskinen, laster du ned FileZilla-programvaren. Hvis FileZilla Client allerede er installert eller ved installasjon, klikker du på FileZilla-ikonet for å åpne programvaren. Logg deg på den eksterne ftp-serveren fra FileZilla ved å skrive inn vertens ftp-nettsted, brukernavn og passord. Last ned de .rar filene til ønsket katalog. Bruk AI-aktivert åpen kildekode-GUI til å vise, score og analysere krystallisasjonsbildene.MERK: GUI-en kan brukes på de fleste Windows-, Mac- og Linux-operativsystemer (OS), og OS-spesifikke instruksjoner for nedlasting finnes på GitHub-nettstedet. MARCO Polo er en åpen kildekode GUI som inkorporerer metadata fra den høye gjennomstrømningen 1,536 krystallisasjonsskjermen implementert på HTX Center. Den er tilgjengelig for alle å laste ned fra GitHub for modifikasjon for å gjenspeile de spesifikke behovene til andre laboratoriegrupper.Åpne .rar filen i GUI-en etter at filen er lastet ned (se tilleggsfigur S1).Klikk på Importer, velg Bilder fra rullegardinmenyen, og velg deretter Fra Rar Archive / Directory. Klikk på Søk etter mappe i popup-vinduet, og naviger deretter til mappen som inneholder bildene. Velg ønsket fil (er), og importer til GUI ved å klikke på Åpne. Vent til filen (e) vises i vinduet Valgte baner . Velg en eller flere filer du vil laste ned til GUI-en, og klikk på Importer kjøringer. Se bildet for den første brønnen i vinduet til lysbildefremviseren i GUI ved å klikke på > -symbolet til venstre for prøvenavnet og deretter velge riktig lest ved å dobbeltklikke på det (leser er oppført etter dato og type bilde-brightfield, UV-TPEF eller SHG). Forstørr bildet ved å endre størrelsen på hele vinduet. Bildedetaljer-boksen inneholder informasjon om bildet, inkludert poengsuminformasjonen (tom til lesingen er scoret). Boksen Cocktaildetaljer inneholder metadata om cocktailkomponentene. Flytt til neste brønn ved å klikke på Neste-knappen i navigasjonspanelet eller trykke på høyre piltast på tastaturet. Naviger til en bestemt brønn ved å skrive inn brønnnummeret i vinduet Etter brønnnummer . Vis alle lesningene (av de som er importert til GUI) ved å merke av for Vis alle datoer . Vis alle spektrene (av de som er importert til GUI) ved å merke av i boksen Vis alle spektra . Klikk på Bytt spektrum-knappen for å se hvert spektrumbilde individuelt. Score krystallbildene ved hjelp av MARCO-algoritmen ved først å markere et bestemt løp fra listen på venstre side av vinduet. Deretter klikker du på Klassifiser valgt Run-knappen . Se MARCO-poenginformasjonen i vinduet Image Details når en bildeavlesning har blitt scoret for alle 1 536 brønner.MERK: Klassifiseringen vil vanligvis ta mellom 2-5 min, avhengig av datamaskinens hastighet og minne tilgjengelig. Algoritmen genererer poeng som klassifiserer innholdet i “krystall”, “klar”, “utfelling” eller “andre” klasser. De numeriske verdiene knyttet til hver brønns klassifisering gjenspeiler sannsynligheten for de brønnholdige objektene i den klassen.Se et delsett av bildene med poengsum ved å merke av i ønskede bokser i Bildefiltrering-panelet og klikke på Send filtre-knappen . For eksempel, se bare bildene klassifisert av MARCO som krystaller ved å merke krystallene og MARCO-boksene og klikke på Send filtre. Score krystallbildene manuelt for å generere settet “human scored”. Tilordne en poengsum til en brønn ved å klikke på riktig knapp (knappene “krystall”, “klar”, “utfelling” eller “annet” er plassert i klassifiseringspanelet nederst i vinduet). Alternativt kan du bruke talltastaturet på tastaturet til å tilordne poengsummen (1 = “krystall”, 2 = “klar”, 3 = “bunnfall”, 4 = “annet”). Angi et bilde med menneskepoeng som en “favoritt” ved å merke av for Favoritt? eske.MERK: Se bare bilder klassifisert av et menneske som krystaller ved å merke av for krystaller og mennesker og klikke på Send filtre. Ved å klikke på Favoritter-boksen i filtreringspanelet begrenses de returnerte bildene ytterligere, og returnerer bare de krystallbildene med menneskepoeng som også er favoritter. Bruk Plate Viewer-fanen til å vise flere brønner samtidig. På den andre Plate Viewer-fanen i kontrollpanelet velger du 16, 64 eller 96 bilder fra rullegardinmenyen i delen Bilder per plate . Bruk kategorien Bildefiltrering til å nedtone bilder som ikke er av interesse. Velg Bruk filter-boksen for å filtrere bildene.MERK: Velg for eksempel boksene “menneskelig” og “krystall”, og bare de brønnene som ble scoret som en krystall av et menneske, vil være lett synlige.Naviger i Plate Viewer-fanen ved å klikke på Neste-knappen for å se neste sett med 16/64/96-bilder. Som standard er bilder som er skåret som krystaller, røde, de som er scoret som klare, blå, de som er scoret som bunnfall, grønne, og de som er scoret som andre, er oransje. Endre fargene ved hjelp av rullegardinmenyene. Velg informasjonen som skal vises på brønnene, ved å merke av i ulike bokser i kategorien Etiketter . Klikk på Lagre visning for å lagre en bildefil av gjeldende visning. Klikk på Bytt spektrum for å veksle mellom brightfield-, SHG- og UV-TPEF-bilder for flerbrønnsbildet. Klikk på Eksporter, og velg riktig filtype fra rullegardinmenyen for å eksportere de scorede filene for bruk i andre programmer.MERK: CSV-filer (kommaseparerte verdier) er kompatible med regnearkprogrammer som Microsoft Excel eller Google Sheets. JSON-filer (JavaScript Object Notation) kan åpnes med de fleste tekstredigeringsprogrammer. PPTX (Powerpoint Presentation) kan brukes til å vise bilder fra Polo, inkludert en sammenligning av brightfield-, UV-TPEF- og SHG-bilder. Filer lagres i .xtal format som skal åpnes på nytt i MARCO Polo GUI.Lagre en fil i .xtal-format ved å klikke på Fil øverst på siden og deretter velge enten Lagre, Kjør eller Lagre, Kjør som. Oppgi et filnavn og en katalogplassering. Åpne .xtal-formatfiler ved å klikke på Importer og velge Bilder og deretter Fra lagret kjøring. Bla etter riktig filplassering, klikk på filnavnet, og klikk deretter på Åpne.

Representative Results

Resultatene av krystallscreeningseksperimentet på 1 536 brønner består av syv komplette lysfeltbildesett samlet inn på dag 0 (negativ kontroll), dag 1, uke 1, uke 2, uke 3, uke 4 og uke 6 (figur 4). SONICC-bilder samles ved 4 ukers tidspunkt for plater inkubert ved 23 °C og ved 6 ukers tidspunkt for plater inkubert ved 4 °C eller 14 °C. Til sammen, når en prøve er sendt, kan brukerne forvente å ha sine plater satt opp innen 1 dag etter ankomst. Bildene lastes opp etter hvert som de samles inn. Krystallisasjonsscreeningseksperimentet avsluttes etter 6 uker. Plateoppsettet på 1,536 brønner gjør at alle screeningseksperimentene kan utføres innenfor samme plate, og dermed begrense prøveforbruket og forenkle avbildning og direkte sammenligning mellom bildebehandlingsmodaliteter. Representative resultater for tidsforløpet av krystallvekst for en enkelt cocktailtilstand er vist i figur 4. Automatisert plateavbildning i løpet av forsøket gjør det mulig å identifisere både raskt og sakte voksende krystaller ved hjelp av lysfeltavbildning. UV-TPEF- og SHG-avbildningen tillater kryssvalidering av treffene observert ved lysfeltavbildning og indikerer at de observerte krystallene er henholdsvis proteinholdige og krystallinske (figur 5A, B). Videre gjør SONICC-avbildning det mulig å identifisere krystaller som er visuelt skjult av bunnfall eller filmer (figur 5C) eller mikrokrystaller som ellers kan forveksles med utfelling (figur 5D). For noen krystaller er mangel på SHG-signal ikke diskvalifiserende, da noen punktgrupper ikke produserer et SHG-signal35,36, som eksemplifisert ved den tetragonale thaumatinkrystallen i figur 5C. Omvendt bør mangel på UV-TPEF-signal for proteiner som mangler tryptofanrester forventes. Observasjonen av UV-TPEF- og SHG-signaler letter også identifiseringen av ikke-proteinsaltkrystaller, som vil vises i lysfelt og vise et sterkt positivt SHG-signal, men vil mangle et UV-TPEF-signal (figur 5E). Bildeanalyse for plateoppsettet er strømlinjeformet med MARCO Polo GUI, som også bunter ftp-dataoverføringen fra HWI-serverne (som et alternativ til å overføre filer med FileZilla). MARCO Polo GUI gjør det enkelt å navigere på plate- og bildevisning og utfører beregningsbildescore ved hjelp av MARCO-algoritmen, slik at bilderesultatene raskt kan lastes ned, vises og analyseres fra HTX-senteret. MARCO-scoringsalgoritmen, som implementert i MARCO Polo GUI, er i stand til å score bilder fra hele 1,536-brønnplaten på mindre enn 5 minutter. Bilder flagget som krystallinske av MARCO-algoritmen kan deretter sorteres av Polo GUI for visning. Siden MARCO-algoritmen ble optimalisert for krystallidentifikasjon og minimering av falske negativer for ikke å gå glipp av noen positive treff, kan poengsummen resultere i falske positive flagg. Likevel vil MARCOs evne til å begrense bildesettet som må undersøkes ved å rette oppmerksomheten mot brønnene med stor sannsynlighet for å inneholde krystaller, resultere i en betydelig reduksjon i databehandlingsbyrden for brukerne. Den praktiske implementeringen av algoritmen i den brukervennlige visningsplattformen MARCO Polo, med sin evne til å sortere bilder basert på MARCO-poeng, forbedrer brukerens evne til å analysere datasettet raskt og nøyaktig bestemme krystalltreff. Figur 1: Skjematisk av et 1,536-brønns krystallisasjonseksperiment med høy gjennomstrømning utført ved HTX-senteret. (1) I dette trinnet tilsettes 5 μL parafinolje og 200 nL cocktail til hver brønn (protokolltrinn 3.1 og trinn 3.5). En tegneserieillustrasjon av en brønn som bare inneholder olje og cocktail og et representativt bilde vises til høyre. (2) Prøver kommer til HTX-senteret (protokoll trinn 5.1). 3) I dette trinnet legges 200 nL prøve til hver brønn (protokolltrinn 5.4). (4) Alle de 1 536 brønnene overvåkes over tid ved hjelp av brightfield-avbildning, 5) samt UV-TPEF- og SHG-modalitetene (protokolltrinn 6). 6) Den AI-aktiverte åpen kildekode-GUI brukes til å vise, score og analysere krystallisasjonsbildene (protokolltrinn 7). Forkortelser: HTX = høy gjennomstrømningskrystallisering; UV-TPEF = UV-to-foton eksitert fluorescens; SHG = andre harmoniske generasjon; AI = kunstig intelligens; GUI = grafisk brukergrensesnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Enkle 1,536-brønnplater som inneholder screeningeksperimenter, avbildet ved hjelp av brightfield, UV-TPEF og SHG-avbildning. Platene med 1.536 brønner er vist med en amerikansk penny for scale (øverst). Hvert screeningeksperiment avbildes én gang før oppsett og seks ganger etter prøvetillegg med brightfield-avbildning (totalt syv bildesett med lysfelt, til venstre). Platene gjennomgår UV-TPEF (midten) og SHG (høyre) avbildning etter 4 uker eller 6 uker. Forkortelser: UV-TPEF = UV-to-foton eksitert fluorescens; SHG = andre harmoniske generasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Skjematisk som viser hvordan platene med 1 536 brønner genereres. Seksten 96-brønns DW-blokker brukes til å stemple ut fire 384-brønnsplater, med hver kvadrant av hver 384-brønnsplate fylt ved å dispensere krystallisasjonscocktailer. Fire 96-brønns DW-blokker fyller en 384-brønnplate (midten). Fire 384-brønnsplater brukes til å stemple ut den enkle 1,536-brønnplaten (høyre). Forkortelse: DW = dyp brønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Representativt tidsforløp for en enkelt brønn i et 1,536-brønns screeningeksperiment. Platene avbildes før prøveoppsett (dag 0), samt med brightfield-avbildning på dag 1, uke 1, uke 2, uke 3, uke 4 og uke 6. Platene inkubert ved 23 °C avbildes med SONICC ved uke 4. Skalastenger = 80 μm (brightfield), 200 μm (SHG, UV-TPEF). Forkortelser: SONICC = andre ordens ikke-lineær avbildning av kirale krystaller; UV-TPEF = UV-to-foton eksitert fluorescens; SHG = andre harmoniske generasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Representative bildebehandlingsresultater for HT 1,536 krystallscreeningseksperimenter. Brightfield-, UV-TPEF- og SHG-bilderesultater er vist for fem eksempelbrønner. (A,B) Proteinkrystaller observert med brightfield-, UV-TPEF- og SHG-avbildning er tydelig synlige i alle tre bildemodaliteter. (C) En proteinkrystall skjult av film i lysfeltavbildning er synlig ved UV-TPEF-avbildning; krystallet observeres ikke ved SHG-avbildning på grunn av punktgruppens inkompatibilitet. (D) Eksempel på mikrokrystaller verifisert ved UV-TPEF- og SHG-avbildning som ellers kan betraktes som utfelling. (E) Eksempel på saltkrystaller som ser krystallinske ut ved lysfelt- og SHG-avbildning, men som ikke viser et UV-TPEF-signal. Skalastenger = 200 μm. Brønndiameter = 0,9 mm. Forkortelser: UV-TPEF = UV-to-foton eksitert fluorescens; SHG = andre harmoniske generasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Tilleggsfigur S1: Åpne bildefiler i MARCO Polo. Bildefiler kan åpnes i MARCO Polo GUI ved å navigere til Import | Bilder-fanen øverst (a). Merk at filer også kan overføres via From FTP-verktøyet direkte i MARCO Polo (a) eller kan overføres via FileZilla som beskrevet i protokolltrinn 7.2. Hvis du vil importere filer som allerede er lastet ned, velger du Bilder | Fra Rar Arkiv / Directory. I popup-vinduet som vises, velger du Bla gjennom etter mappe (b), og navigerer til filkatalogen der platebildefilene er lagret. Når filene er i vinduet Valgte baner (c), markerer du en fil og klikker på Importer kjøringer (d). MARCO Polo GUI vil identifisere de riktige cocktailfilmetadataene som skal importeres med bildene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Metoden beskriver en rørledning med høy gjennomstrømning for proteinkrystallisasjonsscreening som krever så lite som 500 μL prøve for 1,536 individuelle krystallisasjonseksperimenter i mikrobatch-under-olje-formatet. Rørledningen er avhengig av væskehåndteringsrobotikk for raskt og reproduserbart å hjelpe det eksperimentelle oppsettet, samt den beregningsmessige bildeanalyseressursen MARCO Polo, som er tilpasset for å analysere 1,536-brønnplatebilder ved hjelp av MARCO-algoritmen for å identifisere og isolere krystalltreff.

Det lille volumet av individuelle screeningdråper (400 nL totalt med et 1: 1-forhold mellom prøve: cocktail) betyr at ekstremt små prøvevolumer kreves for å identifisere positive krystallisasjonsbetingelser. Disse små dråpestørrelsene produserer nødvendigvis små krystaller som ikke kan fiskes ved tradisjonell looping. Det er utviklet metoder for å høste fra de 1.536 platene³⁷; I tillegg har platene med krystaller blitt brukt direkte ved synkrotronkilder for in situ datainnsamling³⁸. Hvis en robust metode for høsting av disse krystallene ble utviklet, ville fremskritt innen synkrotronteknologi og mikrofokuserte stråler ytterligere gjøre det mulig å oppnå nyttige datasett. I tillegg kan de oppnådde krystallene potensielt brukes som frø for optimaliseringsarbeid.

SONICC-avbildning er helt klart fordelaktig for å identifisere både små proteinkrystaller og proteinkrystaller skjult under bunnfall. Til tross for disse fordelene er ikke alle prøvetyper egnet til SHG- og UV-TPEF-avbildning. For eksempel vil proteiner med få eller ingen aromatiske tryptofanrester vise et tvetydig UV-TPEF-signal. Videre vil krystaller i spesifikke romgrupper, inkludert sentrosymmetriske grupper eller punktgruppe 432, ikke bli oppdaget av SHG-avbildning. Prøver med fluoroforer forstyrrer noen ganger SHG-signalet, noe som resulterer i kansellering av signalet eller økt intensitet, noe som betyr at nøye tolkning av SHG-signaler er nødvendig for metallholdige proteiner og proteiner som inneholder fluorescerende deler. Imidlertid er det i mange tilfeller mulig å rasjonalisere fraværet av et SHG- eller UV-TPEF-signal, og mangelen på disse signalene bør ikke nødvendigvis utelukke tilstedeværelsen av en proteinkrystall.

Microbatch-under-oil-formatet gir et alternativ til den mer vanlige dampdiffusjonsmetoden som brukes til krystallografi med høy gjennomstrømning. Det er viktig at krystalliseringsformatet påvirker treffidentifikasjon³⁹, som gir en begrunnelse for bruken av forskjellige krystallisasjonsformater for screeningarbeid med høy gjennomstrømning. Automatisert bildebehandling og SONICC-aktiverte modaliteter hjelper til med rask identifisering av proteinkrystaller gjennom hele 6 ukers eksperimentelle tidskurs. Til slutt gjør MARCO Polo GUI det mulig for brukere å raskt analysere bilder fra 1,536 forhold for å identifisere lovende treffbrønner for optimalisering. Funksjonene på HTX-senteret, inkludert det robotikkaktiverte eksperimentelle oppsettet med høy gjennomstrømning, kombinert med toppmoderne bildebehandling og beregningsverktøy for analyser, gir et stort bidrag til det strukturelle biologiske samfunnet ved å gi forskere mulighet til effektivt å adressere en primær flaskehals i krystallbasert strukturelt arbeid: å finne krystallisasjonsforhold.

Materials

1536 Well Imp@ct LBR LoBase	Greiner Bio-One	790 801
Acetic acid	Hampton Research	HR2-853
AlumaSeal II Sealing Film	Hampton Research	HR8-069
Ammonium bromide	Molecular Dimensions	MD2-100-247
Ammonium chloride	Hampton Research	HR2-691
Ammonium hydroxide	Hampton Research	HR2-855
Ammonium nitrate	Hampton Research	HR2-665
Ammonium phosphate dibasic	Hampton Research	HR2-629
Ammonium phosphate monobasic	Hampton Research	HR2-555
Ammonium sulfate	Hampton Research	HR2-541
Ammonium thiocyanate	Molecular Dimensions	MD2-100-301
Bicine pH 9.0	Hampton Research	HR2-723
Bis-tris propane pH 7.0	Hampton Research	HR2-993-08
Calcium acetate	Hampton Research	HR2-567
Calcium chloride dihydrate	Hampton Research	HR2-557
CAPS pH 10.0	Rigaku Reagents	none given
ClearSeal Film	Hampton Research	HR4-521
Cobalt sulfate heptahydrate	Molecular Dimensions	MD2-100-42
Crystal Screen HT screen	Hampton Research	HR2-130
Formulator	Formulatrix
Glycerol	Hampton Research	HR2-623
Gryphon liquid handling robot	Art Robbins Instruments
HEPES pH 7.0	Hampton Research	HR2-902-03
HEPES pH 7.5	Hampton Research	HR2-902-08
HWI HTX Center sample submission form			https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/
Hydrochloric acid	Hampton Research	HR2-581
Index HT screen	Hampton Research	HR2-134
Ionic Liquid screen	Hampton Research	HR2-214
Lithium bromide	Molecular Dimensions	MD2-100-312
Lithium chloride	Hampton Research	HR2-631
Lithium sulfate monohydrate	Hampton Research	HR2-545
Magnesium acetate tetrahydrate	Hampton Research	HR2-561
Magnesium chloride hexahydrate	Hampton Research	HR2-559
Magnesium nitrate hexahydrate	Hampton Research	HR2-657
Magnesium sulfate heptahydrate	Hampton Research	HR2-821
Manganese chloride tetrahydrate	Millipore Sigma	63535-50G
Manganese sulfate monohydrate	Molecular Dimensions	MD2-100-310
MARCO Polo GUI download			https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/
Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot	Thermo Scientific
MES pH 6.0	Hampton Research	HR2-943-09
Mosquito liquid handling robot	SPTLabtech
Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F	Sigma Aldrich	PX0045-3
PEG 1000	Hampton Research	HR2-523
PEG 2000	Hampton Research	HR2-592
PEG 20000	Hampton Research	HR2-609
PEG 3350	Hampton Research	HR2-527
PEG 400	Hampton Research	HR2-603
PEG 4000	Hampton Research	HR2-529
PEG 6000	Hampton Research	HR2-533
PEG 8000	Hampton Research	HR2-535
PEG/Ion HT screen	Hampton Research	HR2-139
PEGRx HT screen	Hampton Research	HR2-086
Plate reservations			htslab@hwi.buffalo.edu
Potassium acetate	Hampton Research	HR2-671
Potassium bromide	Hampton Research	HR2-779
Potassium carbonate	Molecular Dimensions	MD2-100-311
Potassium chloride	Hampton Research	HR2-649
Potassium nitrate	Hampton Research	HR2-663
Potassium phosphate dibasic	Hampton Research	HR2-635
Potassium phosphate-monobasic	Hampton Research	HR2-553
Potassium phosphate-tribasic	Molecular Dimensions	MD2-100-309
Potassium thiocyanate	Hampton Research	HR2-695
Rock Imager 1000 with SONICC	Formulatrix
Rock Imager 54	Formulatrix
Rubidium chloride	Millipore Sigma	R2252-10G
SaltRx HT screen	Hampton Research	HR2-136
Silver Bullets screen	Hampton Research	HR2-096
Slice pH screen	Hampton Research	HR2-070
Sodium acetate pH 5.0	Hampton Research	HR2-933-15
Sodium bromide	Hampton Research	HR2-699
Sodium chloride	Hampton Research	HR2-637
Sodium citrate pH 4.2	Hampton Research	HR2-935-01
Sodium citrate pH 5.6	Hampton Research	HR2-735
Sodium hydroxide	Hampton Research	HR2-583
Sodium molybdate dihydrate	Molecular Dimensions	MD2-100-207
Sodium nitrate	Hampton Research	HR2-661
Sodium phosphate monobasic	Hampton Research	HR2-551
Sodium thiosulfate pentahydrate	Molecular Dimensions	MD-100-307
StockOptions Polymer screen	Hampton Research	HR2-227
Tacsimate pH 7	Hampton Research	HR2-755
TAPS pH 9.0	bioWORLD	40121071
Tris pH 8	Hampton Research	HR2-900-11
Tris pH 8.5	Hampton Research	HR2-725
ViaFLO 384	Integra
ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL)	Integra
ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL)	Integra
Zinc acetate dihydrate	Hampton Research	HR2-563