Detta protokoll beskriver kristallisationsscreening med hög genomströmning, allt från 1 536 mikroanalysplattberedning till slutet av ett 6 veckors experimentellt tidsfönster. Detaljer ingår om provuppsättningen, den erhållna avbildningen och hur användare kan utföra analyser med hjälp av ett grafiskt användargränssnitt med artificiell intelligens för att snabbt och effektivt identifiera makromolekylära kristallisationsförhållanden.
Röntgenkristallografi är den vanligaste tekniken för att urskilja makromolekylära strukturer, men det avgörande steget att kristallisera ett protein till ett ordnat gitter som är mottagligt för diffraktion är fortfarande utmanande. Kristallisationen av biomolekyler är till stor del experimentellt definierad, och denna process kan vara arbetsintensiv och oöverkomlig för forskare vid resursbegränsade institutioner. Vid National High-Throughput Crystallization (HTX) Center har mycket reproducerbara metoder implementerats för att underlätta kristalltillväxt, inklusive en automatiserad 1 536-brunns mikrobatch-under-oljeplatta-installation med hög genomströmning utformad för att prova en bred bredd av kristallisationsparametrar. Plattor övervakas med hjälp av toppmoderna avbildningsmetoder under 6 veckor för att ge insikt i kristalltillväxt, samt för att exakt urskilja värdefulla kristallträffar. Dessutom effektiviserar implementeringen av en utbildad algoritm för artificiell intelligens för att identifiera kristallträffar, i kombination med ett användarvänligt gränssnitt med öppen källkod för visning av experimentella bilder, processen att analysera kristalltillväxtbilder. Här beskrivs nyckelprocedurerna och instrumenteringen för beredning av cocktails och kristallisationsplattor, avbildning av plattorna och identifiering av träffar på ett sätt som säkerställer reproducerbarhet och ökar sannolikheten för framgångsrik kristallisation.
Även i en tid av enorma framsteg inom strukturbiologiska metoder fortsätter röntgenkristallografi att vara en pålitlig och populär metod för att generera högkvalitativa strukturella modeller av makromolekyler. Över 85% av alla tredimensionella strukturella modeller som deponeras i Protein Data Bank (PDB) är från kristallbaserade strukturella metoder (från och med januari 2023). 1 Dessutom är röntgenkristallografi fortfarande oumbärlig för att lösa protein-ligandstrukturer, en avgörande komponent i läkemedelsupptäckten och utvecklingsprocessen2. Trots att proteinkristallisation har förblivit den dominerande strukturbiologiska tekniken i över ett halvt sekel, är metoder för att förutsäga kristallisationssannolikheten baserat på fysikaliska egenskaper3 eller sekvens 4,5 fortfarande i sin linda.
Förutsägelsen av kristallisationsförhållanden är ännu mer oklar; Begränsade framsteg har gjorts för att förutsäga sannolika kristallisationsförhållanden även för modellproteiner 6,7. Andra studier har försökt identifiera kristallisationsförhållanden baserade på proteinhomologi och förhållanden som bryts från PDB 8,9,10. Den prediktiva kraften som finns i PDB är dock begränsad, eftersom endast de slutliga, framgångsrika kristallisationsförhållandena deponeras, vilket av nödvändighet missar de ofta omfattande optimeringsexperiment som krävs för att finjustera kristalltillväxten. Vidare saknar många PDB-poster metadata som innehåller dessa detaljer, inklusive cocktailformler, kristallisationsformat, temperatur och tid för att kristallisera11,12. För många proteiner av intresse är därför det mest tillgängliga sättet att bestämma kristallisationsförhållandena experimentellt, med så många förhållanden som möjligt över ett brett spektrum av kemiska möjligheter.
Flera metoder för att göra kristallisationsscreening så fruktbar och grundlig som möjligt har undersökts med stor effekt, inklusive glesa matriser 13, ofullständig faktoriell screening14, tillsatser 15,16, sådd 17 och kärnbildare 18. National HTX Center vid Hauptman-Woodward Medical Research Institute (HWI) har utvecklat en effektiv pipeline för kristallisationsscreening med hjälp av microbatch-under-oil-metoden19, som använder automatiserad vätskehantering och avbildningsmetoder för att effektivisera identifieringen av initiala kristallisationsförhållanden med relativt minimala prov- och cocktailvolymer (figur 1). Uppsättningen av 1 536 unika cocktails är baserade på förhållanden som tidigare fastställts för att bidra till proteinkristalltillväxt och är utformade för att vara kemiskt olika för att prova ett stort antal möjliga kristallisationsförhållanden20,21,22. Den breda provtagningen av kristallisationsförhållanden ökar sannolikheten för att observera en eller flera kristallisationsledningar.
Få formella analyser av hur många villkor som behövs för screening har dykt upp i litteraturen. En studie fokuserade på urvalslayouten för olika skärmar och fann att slumpmässigt urval av komponenter (liknande en ofullständig faktoriell) representerade den mest grundliga och effektiva provtagningsmetoden23. En annan studie av screening noterade att det har förekommit många fall när den mycket grundliga 1,536-skärmen har gett endast en enda kristallträff24, och en mycket ny studie betonade att de flesta kommersiella skärmar undersamplar kristallisationsutrymmet som är känt för att vara associerat med screeningträffar25. Inte alla kristallisationsledningar kommer att ge en diffraktionskvalitetskristall som är lämplig för datainsamling på grund av inneboende störning inom kristallen, diffraktionsbegränsningar eller kristallbrister; Därför har gjutning av ett bredare nät för förhållanden den extra fördelen att tillhandahålla alternativa kristallformer för optimering.
Formatet för proteinkristallisationsexperiment har också en inverkan på skärmens framgång. Ångdiffusion är den vanligaste inställningen för kristallisationsapplikationer med hög genomströmning och används vid toppmoderna kristallisationscentra, inklusive EMBL Hamburg och Institut Pasteur screeningcentra med hög genomströmning26,27,28. HTX-centret använder mikrobatch-under-oil-metoden; Även om det är mindre vanligt är det en robust metod som minimerar konsumtionen av prov- och kristallisationscocktails20,21,22. En fördel med mikrobatch-under-oil-metoden, särskilt vid användning av en paraffinolja med hög viskositet, är att endast liten avdunstning sker inom droppen under experimentet, vilket innebär att jämviktskoncentrationen uppnås vid droppblandning. Om positiva kristallisationsresultat observeras i mikrobatch-under-oil-metoden är reproduktionen av dessa förhållanden typiskt enklare än i ångdiffusionsinställningar, där kristallisation sker vid någon odefinierad punkt under jämvikten mellan kristallisationsfallet och behållaren. Reproducerbarheten av träffar är önskvärd för kristallisationsmetoder med hög genomströmning, som producerar oöverkomligt små proteinkristaller som vanligtvis behöver optimeras för enkristallröntgenexperiment.
Kristallisationsskärmen med hög genomströmning för lösliga proteiner består av cocktails som tillagas internt, färdiga kommersiella skärmar och internt modifierade kommersiella skärmar22. Cocktailsna utvecklades ursprungligen med hjälp av den ofullständiga faktoriella strategin med tidigare framgångsrika kristallisationscocktails20. Reagenserna i skärmen som är kommersiellt tillgängliga inkluderar matriser av polymerer, kristallisationssalter, PEG och jonkombinationer och skärmar som använder gles matris och ofullständiga faktoriella metoder. Det finns också reagens som modifieras innan de ingår i skärmen: en additiv skärm, en pH- och buffertskärm, en jonisk flytande tillsatsskärm och en polymerskärm.
Kraften i kända kristallisationsförhållanden och strategier har utnyttjats i de 1 536 kristalliseringscocktailsna, tillsammans med fördelarna med mikrobatch-under-oljesystemet för att generera en rörledning som använder automatiserad vätskehantering, automatiserad ljusfältsavbildning och andra ordningens icke-linjära avbildning av kirala kristaller (SONICC). Automatiseringen av både vätskehantering och avbildning ger fördelarna med färre våtlaboratorietimmar och högre reproducerbarhet. Den höga genomströmningen av automatiserad kristallisationsscreening kräver automatisering av processen för övervakning av kristalltillväxt. Dessa framsteg uppnås med toppmodern bildteknik för att hjälpa till att identifiera positiva kristallträffar. Både standard ljusfältsavbildning av plattor, liksom multifotonmetoder för förbättrad detektion, används via ett kristallavbildningssystem med SONICC (figur 2). SONICC kombinerar andra harmoniska generationen (SHG)29 mikroskopi och ultraviolett tvåfotonexciterad fluorescens (UV-TPEF)30 mikroskopi för att detektera mycket små kristaller, liksom de som döljs av fällning. SONICC-avbildningen informerar om brunnarna innehåller protein (via UV-TPEF) och kristaller (via SHG). Utöver den positiva identifieringen av proteinkristaller kan ytterligare information också erhållas med hjälp av toppmoderna avbildningsmetoder. Cocktail-only imaging före provtillsats fungerar som en negativ kontroll; Dessa bilder kan identifiera brunnens utseende före provtillsats, inklusive när det gäller saltkristaller och skräp. Dessutom hjälper SHG och UV-TPEF-avbildning att skilja proteinkristaller från saltkristaller och kan användas för att visualisera protein-nukleinsyrakomplexkomplext material31.
Kristallisationsexperiment med hög genomströmning som genomgår upprepad övervakning via avbildning resulterar i en mycket stor mängd bilder som behöver undersökas. Automatiserade kristallpoängeringsmetoder har utvecklats för att minska belastningen på användaren och öka sannolikheten för att identifiera positiva kristallträffar. HTX-centret deltog i utvecklingen av MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO) poängalgoritm, en tränad djup faltningsarkitektur för neurala nätverk som utvecklats av ett konsortium av akademiska, ideella, statliga och industriella partners för att klassificera brightfield-brunnsbilder32. Algoritmen tränades på nästan en halv miljon ljusfältsbilder från kristallisationsexperiment från flera institutioner med olika kristallisationsmetoder och olika bildgivare. Algoritmen matar ut en probabilistisk poäng som indikerar om en given bild faller i fyra möjliga bildklasser: “kristall”, “klar”, “fällning” och “annan”. MARCO har en rapporterad klassificeringsnoggrannhet på 94,5%. Kristalldetektering förbättras ytterligare med programvara som implementerar algoritmen och tillhandahåller ett grafiskt användargränssnitt (GUI) för tillgänglig och enkel bildvisning, aktiverad med AI-aktiverade poängfunktioner32,33. MARCO Polo GUI är utformat för att fungera sömlöst med installationen av bild- och datahanteringssystemet i HTX Center för att identifiera träffar på skärmen med 1 536 brunnar, med mänskligt engagemang för att undersöka utdata från sorterade listor. Dessutom, som programvara med öppen källkod tillgänglig på GitHub, är GUI lätt tillgänglig för modifiering för att återspegla de specifika behoven hos andra laboratoriegrupper.
Här beskrivs processen att inrätta ett mikrobatch-under-oljeexperiment med hög genomströmning med hjälp av robotvätskehantering för att leverera både cocktail och protein. HTX Center har ett unikt utbud av instrument och resurser som inte finns på andra institutioner, med målet att tillhandahålla screeningtjänster och utbildningsresurser till intresserade användare. Att demonstrera metoderna och kapaciteten hos robotaktiverade tekniker med hög genomströmning kommer att göra det möjligt för samhället att ha kunskap om tillgänglig teknik och fatta beslut för sina egna strukturbestämningsinsatser.
Metoden beskriver en pipeline med hög kapacitet för proteinkristallisationsscreening som kräver så lite som 500 μL prov för 1 536 individuella kristallisationsexperiment i mikrobatch-under-olja-formatet. Rörledningen förlitar sig på vätskehanteringsrobotik för att snabbt och reproducerbart hjälpa den experimentella installationen, liksom beräkningsbildanalysresursen MARCO Polo, som är anpassad för att analysera plattbilder med 1 536 brunnar med hjälp av MARCO-algoritmen för att identifiera och isolera kristallträffar.
Den lilla volymen av individuella screeningdroppar (400 nL totalt med ett 1: 1-förhållande av prov: cocktail) innebär att extremt små provvolymer krävs för att identifiera positiva kristallisationsförhållanden. Dessa små droppstorlekar producerar nödvändigtvis små kristaller som inte kan fiskas med traditionell slinga. Metoder har utvecklats för att skörda från de 1 536 plattorna37; Dessutom har plattorna med kristaller använts direkt vid synkrotronkällor för in situ-datainsamling 38. Om en robust metod för att skörda dessa kristaller utvecklades skulle framsteg inom synkrotronteknik och mikrofokuserade strålar ytterligare göra det möjligt att erhålla användbara dataset. Dessutom kan de erhållna kristallerna potentiellt användas som frön för optimeringsinsatser.
SONICC imaging är klart fördelaktigt för att identifiera både små proteinkristaller och proteinkristaller dolda under fällning. Trots dessa fördelar är inte alla provtyper mottagliga för SHG- och UV-TPEF-avbildning. Till exempel kommer proteiner med få eller inga aromatiska tryptofanrester att visa en tvetydig UV-TPEF-signal. Dessutom kommer kristaller i specifika rymdgrupper, inklusive centrosymmetriska grupper eller punktgrupp 432, att detekteras av SHG-avbildning. Prover med fluoroforer stör ibland SHG-signalen, vilket resulterar i att signalen avbryts eller ökad intensitet, vilket innebär att noggrann tolkning av SHG-signaler krävs för metallinnehållande proteiner och proteiner som innehåller fluorescerande delar. I många fall är det emellertid möjligt att rationalisera frånvaron av en SHG- eller UV-TPEF-signal, och bristen på dessa signaler bör inte nödvändigtvis utesluta närvaron av en proteinkristall.
Microbatch-under-oil-formatet ger ett alternativ till den vanligare ångdiffusionsmetoden som används för kristallografi med hög genomströmning. Det är viktigt att kristallisationsformatet påverkar träffidentifiering39, vilket ger en motivering för användningen av olika kristallisationsformat för screeninginsatser med hög genomströmning. Automatiserad avbildning och SONICC-aktiverade modaliteter hjälper till att snabbt identifiera proteinkristaller under hela den 6 veckors experimentella tidskursen. Slutligen gör MARCO Polo GUI det möjligt för användare att snabbt analysera bilder från 1 536 förhållanden för att identifiera lovande träffbrunnar för optimering. Kapaciteten vid HTX-centret, inklusive den robotaktiverade experimentella installationen med hög genomströmning, i kombination med de senaste bild- och beräkningsverktygen för analyser, ger ett stort bidrag till strukturbiologisamhället genom att ge forskare möjlighet att effektivt ta itu med en primär flaskhals i kristallbaserat strukturellt arbete: att hitta kristallisationsförhållanden.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill uttrycka vår tacksamhet till våra användare för att de anförtrott sina värdefulla prover till oss för kristallscreening, samt för att ge kritisk feedback och förfrågningar som har hjälpt oss att förfina och utveckla våra resurser för att bättre tjäna strukturbiologigemenskapen. Vi vill också tacka Ethan Holleman, Dr. Lisa J Keefe och Dr. Erica Duguid, som drev utvecklingen av MARCO Polo GUI. Vi vill tacka HWI-kollegorna för deras stöd och förslag, särskilt Dr. Diana CF Monteiro. Vi erkänner finansieringsstöd från National Institutes of Health, R24GM141256.
1536 Well Imp@ct LBR LoBase | Greiner Bio-One | 790 801 | |
Acetic acid | Hampton Research | HR2-853 | |
AlumaSeal II Sealing Film | Hampton Research | HR8-069 | |
Ammonium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-247 | |
Ammonium chloride | Hampton Research | HR2-691 | |
Ammonium hydroxide | Hampton Research | HR2-855 | |
Ammonium nitrate | Hampton Research | HR2-665 | |
Ammonium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-629 | |
Ammonium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-555 | |
Ammonium sulfate | Hampton Research | HR2-541 | |
Ammonium thiocyanate | Molecular Dimensions | MD2-100-301 | |
Bicine pH 9.0 | Hampton Research | HR2-723 | |
Bis-tris propane pH 7.0 | Hampton Research | HR2-993-08 | |
Calcium acetate | Hampton Research | HR2-567 | |
Calcium chloride dihydrate | Hampton Research | HR2-557 | |
CAPS pH 10.0 | Rigaku Reagents | none given | |
ClearSeal Film | Hampton Research | HR4-521 | |
Cobalt sulfate heptahydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-42 | |
Crystal Screen HT screen | Hampton Research | HR2-130 | |
Formulator | Formulatrix | ||
Glycerol | Hampton Research | HR2-623 | |
Gryphon liquid handling robot | Art Robbins Instruments | ||
HEPES pH 7.0 | Hampton Research | HR2-902-03 | |
HEPES pH 7.5 | Hampton Research | HR2-902-08 | |
HWI HTX Center sample submission form | https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/ | ||
Hydrochloric acid | Hampton Research | HR2-581 | |
Index HT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
Ionic Liquid screen | Hampton Research | HR2-214 | |
Lithium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-312 | |
Lithium chloride | Hampton Research | HR2-631 | |
Lithium sulfate monohydrate | Hampton Research | HR2-545 | |
Magnesium acetate tetrahydrate | Hampton Research | HR2-561 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Hampton Research | HR2-559 | |
Magnesium nitrate hexahydrate | Hampton Research | HR2-657 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Hampton Research | HR2-821 | |
Manganese chloride tetrahydrate | Millipore Sigma | 63535-50G | |
Manganese sulfate monohydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-310 | |
MARCO Polo GUI download | https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/ | ||
Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot | Thermo Scientific | ||
MES pH 6.0 | Hampton Research | HR2-943-09 | |
Mosquito liquid handling robot | SPTLabtech | ||
Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F | Sigma Aldrich | PX0045-3 | |
PEG 1000 | Hampton Research | HR2-523 | |
PEG 2000 | Hampton Research | HR2-592 | |
PEG 20000 | Hampton Research | HR2-609 | |
PEG 3350 | Hampton Research | HR2-527 | |
PEG 400 | Hampton Research | HR2-603 | |
PEG 4000 | Hampton Research | HR2-529 | |
PEG 6000 | Hampton Research | HR2-533 | |
PEG 8000 | Hampton Research | HR2-535 | |
PEG/Ion HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
PEGRx HT screen | Hampton Research | HR2-086 | |
Plate reservations | htslab@hwi.buffalo.edu | ||
Potassium acetate | Hampton Research | HR2-671 | |
Potassium bromide | Hampton Research | HR2-779 | |
Potassium carbonate | Molecular Dimensions | MD2-100-311 | |
Potassium chloride | Hampton Research | HR2-649 | |
Potassium nitrate | Hampton Research | HR2-663 | |
Potassium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-635 | |
Potassium phosphate-monobasic | Hampton Research | HR2-553 | |
Potassium phosphate-tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-309 | |
Potassium thiocyanate | Hampton Research | HR2-695 | |
Rock Imager 1000 with SONICC | Formulatrix | ||
Rock Imager 54 | Formulatrix | ||
Rubidium chloride | Millipore Sigma | R2252-10G | |
SaltRx HT screen | Hampton Research | HR2-136 | |
Silver Bullets screen | Hampton Research | HR2-096 | |
Slice pH screen | Hampton Research | HR2-070 | |
Sodium acetate pH 5.0 | Hampton Research | HR2-933-15 | |
Sodium bromide | Hampton Research | HR2-699 | |
Sodium chloride | Hampton Research | HR2-637 | |
Sodium citrate pH 4.2 | Hampton Research | HR2-935-01 | |
Sodium citrate pH 5.6 | Hampton Research | HR2-735 | |
Sodium hydroxide | Hampton Research | HR2-583 | |
Sodium molybdate dihydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-207 | |
Sodium nitrate | Hampton Research | HR2-661 | |
Sodium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-551 | |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Molecular Dimensions | MD-100-307 | |
StockOptions Polymer screen | Hampton Research | HR2-227 | |
Tacsimate pH 7 | Hampton Research | HR2-755 | |
TAPS pH 9.0 | bioWORLD | 40121071 | |
Tris pH 8 | Hampton Research | HR2-900-11 | |
Tris pH 8.5 | Hampton Research | HR2-725 | |
ViaFLO 384 | Integra | ||
ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL) | Integra | ||
ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL) | Integra | ||
Zinc acetate dihydrate | Hampton Research | HR2-563 |