यहां, हम स्नातक भागीदारी और सीखने पर जोर देने के साथ क्रोमोसोम रचना कैप्चर (3 सी) तकनीक का एक अनुकूलन प्रस्तुत करते हैं।
क्रोमोसोम रचना कैप्चर (3 सी) एक शक्तिशाली उपकरण है जिसने समान तकनीकों (जैसे, हाई-सी, 4 सी, और 5 सी, जिसे यहां 3 सी तकनीकों के रूप में संदर्भित किया गया है) के एक परिवार को जन्म दिया है जो क्रोमैटिन के त्रि-आयामी संगठन की विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं। 3 सी तकनीकों का उपयोग अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला में किया गया है, कैंसर कोशिकाओं में क्रोमैटिन संगठन में परिवर्तन की निगरानी से लेकर जीन प्रमोटरों के साथ किए गए एन्हांसर संपर्कों की पहचान करने तक। जबकि इन तकनीकों का उपयोग करने वाले कई अध्ययन जटिल नमूना प्रकारों (यानी, एकल-कोशिका विश्लेषण) के साथ बड़े जीनोम-व्यापी प्रश्न पूछ रहे हैं, अक्सर जो खो जाता है वह यह है कि 3 सी तकनीक बुनियादी आणविक जीव विज्ञान विधियों में आधारित हैं जो अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होते हैं। क्रोमैटिन संगठन के कसकर केंद्रित प्रश्नों को संबोधित करके, इस अत्याधुनिक तकनीक का उपयोग स्नातक अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशाला अनुभव को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। यह पेपर एक 3 सी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और स्नातक अनुसंधान और शिक्षण अनुभवों में मुख्य रूप से स्नातक संस्थानों में कार्यान्वयन के लिए अनुकूलन और जोर के बिंदु प्रदान करता है।
एक जीव का जीनोम न केवल कार्य के लिए आवश्यक सभी जीनों को रखता है, बल्कि उनका उपयोग कैसे और कब करना है, इस पर सभी निर्देश भी रखता है। यह जीनोम तक पहुंच को विनियमित करना सेल के सबसे महत्वपूर्ण कार्यों में से एक बनाता है। जीन फ़ंक्शन को नियंत्रित करने के लिए कई तंत्र हैं; हालांकि, इसके आधार स्तर पर, जीन विनियमन नियामक प्रतिलेखन कारकों (ट्रांस-कारकों) की क्षमता को उनके विशिष्ट डीएनए अनुक्रमों (सीआईएस-नियामक अनुक्रमों) से बांधने की क्षमता तक आता है। यह एक जन्मजात क्षमता नहीं है; इसके बजाय, यह नाभिक में जीनोम के संगठन / संरचना द्वारा नियंत्रित होता है, जो ट्रांस-फैक्टर 1,2,3 के लिए सीआईएस-नियामक अनुक्रमों की उपलब्धता / जोखिम को नियंत्रित करता है। यदि ट्रांस-कारक अपने सीआईएस-नियामक अनुक्रमों को नहीं पा सकते हैं, तो ट्रांस-कारक अपने नियामक कार्यों को नहीं कर सकते हैं। इसने यह समझने को बनाया है कि नाभिक में जीनोम कैसे व्यवस्थित होते हैं, जांच का एक महत्वपूर्ण स्रोत है।
यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि इंटरफेज़ के दौरान, नाभिक में यूकेरियोटिक गुणसूत्र परमाणु लैमिना और परमाणु मैट्रिक्स (चित्रा 1) से जुड़े अपने स्वयं के डोमेन पर कब्जा कर लेते हैं, इस प्रकार क्रोमोसोम को स्पेगेटी की प्लेट पर नूडल के बजाय पिज्जा के टुकड़े की तरह बनाते हैं। क्रोमोसोम आंशिक रूप से प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन (क्रोमैटिन) द्वारा संघनित होते हैं जो क्रोमोसोम के कुछ हिस्सों को मोड़ते हैं और लूप करते हैं। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, तीन आयामी डीएनए फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश), और डीएनए टैगिंग तकनीकों (यानी, फ्लोरोसेंट और कृत्रिम डीएनए मिथाइलेशन) के माध्यम से, क्रोमैटिन के निष्क्रिय डोमेन को परमाणु परिधि 4,5,6 के साथ कसकर पैक किया गया है, जबकि नाभिक के इंटीरियर में सक्रिय, कम संघनित क्रोमैटिन के हिस्सेपाए जाते हैं। 10. ये प्रयोग क्रोमोसोम गतिशीलता का एक व्यापक कोण दृश्य प्रदान करते हैं, लेकिन DNase 11,12 और न्यूक्लियोसोम 13,14,15 अध्ययनों में देखे गए जीन प्रोमोटर्स के आसपास स्थानीय रूप से होने वाले परिवर्तनों को पकड़ने के लिए बहुत कम हैं।
उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रोमैटिन गतिशीलता को अनलॉक करने की कुंजी 3 डी क्रोमोसोम मैपिंग तकनीक, 3 सी का निर्माण था। 3 सी तकनीक में स्वयं चार मुख्य चरण शामिल हैं: क्रोमैटिन का क्रॉसलिंकिंग, प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा क्रोमैटिन पाचन, क्रोमैटिन बंधाव और डीएनए शुद्धिकरण (चित्रा 2)। इस प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न नए कृत्रिम डीएनए टुकड़ों को तब डीएनए16 के रैखिक रूप से दूर के टुकड़ों के बीच घनिष्ठ भौतिक संबंध को प्रकट करने की विशेषता हो सकती है। 3 सी तकनीक कई स्पिन-ऑफ तकनीकों के निर्माण का आधार बन गई जो व्यापक जीनोम-वाइड प्रश्न (जैसे, हाई-सी, 4 सी, सीएचआईपी-सी) पूछने के लिए 3 सी के प्रारंभिक चरणों का उपयोग करती है। 3 सी तकनीकों के इस परिवार ने पहचान की है कि गुणसूत्रों को कई असतत इकाइयों में व्यवस्थित किया जाता है जिन्हें टोपोलॉजिकल रूप से जुड़े डोमेन (टीएडी) कहा जाता है। टीएडी जीनोम में एन्कोड किए गए हैं और क्रोमैटिन लूप द्वारा परिभाषित किए जाते हैं जो अनलूप ्ड सीमाओं16,17,18,19 से घिरे होते हैं। टीएडी सीमाओं को दो क्रमिक रूप से संरक्षित और सर्वव्यापी कारकों द्वारा बनाए रखा जाता है, जिसमें सीसीसीटी बाइंडिंग फैक्टर (सीटीसीएफ) और सामंजस्य शामिल हैं, जो अलग-अलग टीएडी के भीतर लूप को16,20 से बातचीत करने से रोकते हैं। लूप को उनके नियामक अनुक्रमों के साथ-साथ सीटीसीएफऔर सामंजस्य 21 के साथ ट्रांस-कारकों की बातचीत द्वारा मध्यस्थ किया जाता है।
हालांकि 3 सी प्रौद्योगिकियों का उपयोग करने वाले कई अध्ययन व्यापक जीनोम-व्यापक प्रश्न पूछते हैं और जटिल नमूना संग्रह तकनीकों को नियोजित करते हैं, 3 सी तकनीक का निर्माण बुनियादी आणविक जीव विज्ञान तकनीकों पर आधारित है। यह स्नातक अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशालाओं दोनों में तैनाती के लिए 3 सी पेचीदा बनाता है। 3 सी तकनीक को छोटे केंद्रित प्रश्नों के लिए नियोजित किया जा सकता है और पूछे गए प्रश्नों के फोकस और दिशा के आधार पर ऊपर या नीचे (एकल जीन22, क्रोमोसोम16, और / या जीनोम18) स्केलिंग के लिए स्वाभाविक रूप से लचीला है। इस तकनीक को मॉडल सिस्टम 7,16,19,23 की एक विस्तृत श्रृंखला पर भी लागू किया गया है और इसके उपयोग में बहुमुखी साबित हुआ है। यह 3 सी को अंडरग्रेजुएट्स के लिए एक उत्कृष्ट तकनीक बनाता है जिसमें छात्र सामान्य आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में अनुभव प्राप्त कर सकते हैं, जबकि निर्देशित प्रश्नों के उत्तर देने में मूल्यवान अनुभव भी प्राप्त कर सकते हैं।
यहां प्रस्तुत पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल24,25,26,27 के आधार पर 3 सी लाइब्रेरी तैयारी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है। इस प्रोटोकॉल को लगभग 1 × 107 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है, हालांकि इसने 1 × 105 कोशिकाओं के साथ 3 सी पुस्तकालय उत्पन्न किए हैं। यह प्रोटोकॉल बहुमुखी साबित हुआ है और इसका उपयोग ज़ेबराफ़िश भ्रूण, ज़ेबराफ़िश सेल लाइनों और युवा-वयस्क (वाईए) केनोरहाब्डिस एलिगेंस (राउंडवर्म) से 3 सी पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए किया गया है। प्रोटोकॉल स्तनधारी सेल लाइनों और, आगे अनुकूलन के साथ, खमीर के लिए भी उपयुक्त होना चाहिए।
इन अनुकूलन का लक्ष्य अंडरग्रेजुएट्स के लिए 3 सी को अधिक सुलभ बनाना है। उन तकनीकों का उपयोग करने के लिए सावधानी बरती गई है जो उन तकनीकों के समान हैं जिन्हें स्नातक शिक्षण प्रयोगशाला में पूरा किया जा सकता है। 3 सी तकनीक स्नातक के लिए बुनियादी आणविक जीव विज्ञान तकनीकों को सीखने के लिए कई सीखने के अवसर प्रदान करती है जो स्नातक स्तर की पढ़ाई के बाद बेंच पर, कक्षा में और उनके प्रयासों में उनके विकास को लाभान्वित करेगी।
3 सी एक शक्तिशाली तकनीक है जो बुनियादी आणविक तकनीकों में निहित है। यह मौलिक उपकरणों की नींव है जो 3 सी को अंडरग्रेजुएट्स के साथ उपयोग करने के लिए ऐसी पेचीदा तकनीक बनाती है। इतने व्यापक पैमाने पर क्रोमैटिन गतिशीलता का अवलोकन करने वाले कई हालिया अध्ययनों के साथ, इन परिणामों का उपयोग करके एकल जीन या जीनोमिक क्षेत्र पर एक संकीर्ण-केंद्रित प्रयोग तैयार करने में स्नातक अनुसंधान में एक अद्वितीय और प्रभावशाली प्रयोग बनाने की क्षमता है। अक्सर, इस तरह के प्रयोगों को अंडरग्रेजुएट्स के लिए बहुत उन्नत माना जाता है, लेकिन सावधानीपूर्वक योजना के साथ, वे आसानी से प्राप्त किए जा सकते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि 3 सी लाइब्रेरी द्वारा कैप्चर किए गए क्रोमैटिन कनेक्शन की जांच करने के लिए डिज़ाइन किए गए परख अर्ध-मात्रात्मक समापन बिंदु पीसीआर से पूरे जीनोम अनुक्रमण तक भिन्न हो सकते हैं। वास्तव में, पहले 3 सी पेपर16 से डेटा क्यूपीसीआर से उत्पन्न किया गया था। परख की इस विस्तृत श्रृंखला का उपयोग किया जा सकता है क्योंकि सभी 3 सी प्रौद्योगिकियां एक ही उत्पाद का उत्पादन करती हैं- नाभिक में 3 डी कनेक्शन का प्रतिनिधित्व करने वाले डीएनए टुकड़ों की एक लाइब्रेरी।
यहां प्रस्तुत एक अधिक लचीला और समायोजित प्रोटोकॉल का अनुकूलन है जो स्नातक शोधकर्ताओं के लिए बेहतर फिट है। ऊपर सूचीबद्ध विराम अवधि का अर्थ है रात भर की देरी; हालांकि, ये विराम सप्ताहांत में और कोशिकाओं और नाभिक के मामले में, हफ्तों तक बढ़ सकते हैं। सबसे महत्वपूर्ण विचार यह है कि काम कब पूरा होगा। अक्सर प्रोटोकॉल में, समय-संवेदनशील कदम होते हैं जब रोकना एक विकल्प नहीं होता है। कुछ बिंदुओं (दिन 1 और दिन 2) के बाहर, नमूने को रोकने और फ्रीज करने के लिए कई स्थान हैं। अंडरग्रेजुएट्स के साथ काम करते समय ये महत्वपूर्ण होते हैं जहां प्रयोगशाला के काम के शेड्यूल और समय को लचीला होना चाहिए। प्रोटोकॉल में इन स्टॉप को इंजीनियरिंग करने के अलावा, अंडरग्रेजुएट्स को जोड़े या यहां तक कि तीन या चार के छोटे समूहों में काम करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। समूह इस प्रोटोकॉल के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, क्योंकि छात्र एक-दूसरे का समर्थन कर सकते हैं और एक दोस्त प्रणाली बना सकते हैं ताकि हर कोई सुरक्षित रूप से काम कर सके। लैब का काम भी शामिल अन्य लोगों के साथ अधिक मजेदार है। समूहों के साथ, छात्र अभी भी एक ही प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हुए क्रोमैटिन के संगठन पर केंद्रित विभिन्न प्रकार के प्रश्नों पर भी काम कर सकते हैं। इस प्रकार, यहां तक कि जब छात्र अलग-अलग परियोजनाओं पर काम कर रहे हैं, प्रोटोकॉल उनके प्रयासों को जोड़ता है, और इस वजह से, वे एक-दूसरे का समर्थन कर सकते हैं।
अन्य अनुकूलन इस तथ्य के आसपास काम करने के लिए हैं कि कुछ विशेष उपकरण और उपकरण आवश्यक रूप से सभी स्नातक संस्थानों में नहीं पाए जाते हैं। उपकरण के इन टुकड़ों में क्यूपीसीआर थर्मोसाइकलर्स, जेल प्रलेखन प्रणाली और नैनो वॉल्यूम स्पेक्ट्रोमीटर शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। दरअसल, उपकरण के ये टुकड़े सुविधाजनक हैं लेकिन एक आवश्यकता नहीं है। यहां, 3 सी की क्लासिक विधि को प्राइमर डिजाइन भाग में भी वर्णित किया गया है; इसमें रुचि के जीनोमिक स्थान की पहचान करना और उससे, क्रोमैटिन संपर्क बिंदुओं के लिए अन्य जीनोमिक लोकी का आकलन करना शामिल है। यह तकनीक भी अच्छी तरह से काम करती है यदि एक प्रकाशित डेटासेट का उपयोग किया जाता है, जैसे कि हाई-सी का उपयोग करने वाला डेटासेट, जहां ज्ञात सकारात्मक (कनेक्टिंग) और नकारात्मक (गैर-कनेक्टिंग) लोकी की पहचान की जाती है। इन प्रकाशित डेटा सेटों का उपयोग करके प्रयोगों को डिजाइन करना शिक्षण प्रयोगशालाओं के लिए एक और महान अनुकूलन है, क्योंकि क्रोमैटिन कनेक्शन की सफल पहचान की संभावना आमतौर पर अधिक होती है। इसके अलावा, शोध लेख कक्षा में चर्चा की जा सकती है और एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल 3 सी उत्पाद गठन की कल्पना करने के लिए एक संशोधित क्यूपीसीआर दृष्टिकोण का उपयोग करता है। 3 सी तकनीक की सफलता के लिए नियंत्रण आवश्यक हैं। प्रत्येक प्रयोग 3 सी प्रक्रिया के पूरा होने का निर्धारण करने के लिए नमूना नियंत्रण और प्राइमर नियंत्रण दोनों का उपयोग करता है। नमूना नियंत्रण में एक अनपचा हुआ नियंत्रण (जीनोमिक डीएनए) और पचा हुआ नियंत्रण शामिल है। अनडाइजेस्टेड कंट्रोल प्राइमर सेट के लिए बेसलाइन सिग्नल निर्धारित करता है और पाचन दक्षता निर्धारित करने के लिए क्रॉस-लिंक्ड पाचन नियंत्रण के साथ उपयोग किया जाता है। इस मान की तुलना बिना पचे हुए नियंत्रण से करना इस बात का संकेत देता है कि नमूना कितनी अच्छी तरह पच गया था।
पीसीआर के लिए प्राइमरों में एक नियंत्रण प्राइमर और परीक्षण प्राइमर शामिल हैं। नियंत्रण प्राइमर एक प्राइमर सेट है जो जीनोमिक क्षेत्र के पास है और इसमें प्रतिबंध स्थल नहीं है। यह परीक्षण प्राइमर पीसीआर उत्पादों की प्रचुरता का निर्धारण करने के लिए आधार रेखा प्रदान करता है। टेस्ट प्राइमर आगे और रिवर्स प्राइमर होते हैं जो एक विशेष जीनोमिक स्थान के लिए एक प्रतिबंध स्थल को फ्लैंक करते हैं (चित्रा 3)। इन प्राइमर सेटों का उपयोग करने वाली प्रतिक्रियाओं की तुलना पाचन दक्षता निर्धारित करने के लिए की जाती है, क्योंकि प्रतिबंध साइट में कटौती होने पर उत्पाद की बहुतायत कम हो जानी चाहिए। क्रोमैटिन संगठन का निर्धारण करने में, एक लोकस से एक परीक्षण प्राइमर को एक अलग जीनोमिक लोकस से दूसरे परीक्षण प्राइमर के साथ जोड़ा जाता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि ये दो लोकी 3 डी स्पेस में एक साथ करीब हैं या नहीं। उस स्थिति में, उम्मीद यह है कि एक पीसीआर उत्पाद केवल टेम्पलेट के रूप में 3 सी नमूने का उपयोग करके पाया जाएगा।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यहां तक कि मान्य प्राइमरों में भी विफल होने की प्रवृत्ति होती है (चित्रा 4: आर 14 प्राइमर सेट)। इसके अलावा, पीसीआर उत्पादों को अक्सर नियंत्रण प्रतिक्रियाओं में और उन प्रतिक्रियाओं में पहचाना जाता है जिनमें क्रोमैटिन कनेक्शन की भविष्यवाणी नहीं की जाती है (जैसे कि पचा हुआ नियंत्रण, क्योंकि यह लिगेट नहीं है)। ये उदाहरण अनुक्रमित होते हैं और या तो सेंगर क्यूसी को विफल करते हैं या परिभाषित अनुक्रम के बिना वापस आते हैं (चित्रा 5)। इसके अतिरिक्त, पारंपरिक 3 सी प्रयोग एक “नियंत्रण टेम्पलेट” उत्पन्न करते हैं, जो एक अनक्रॉस-लिंक्ड, पचा हुआ और लिगेटेड डीएनए नमूना है, जो सभी संभावित लिगेटेड टुकड़ों का प्रतिनिधित्व करता है जिन्हें डीएनए की दी गई मात्रा के साथ उत्पादित किया जा सकता है। “नियंत्रण टेम्पलेट” दो जीनोमिक लोकी के बीच क्यूपीसीआर संकेतों की तीव्रता की तुलना करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि सिग्नल एक सच्ची बातचीत का प्रतिनिधित्व करता है या सिर्फ एक यादृच्छिक संघ है। “नियंत्रण टेम्पलेट” बनाना समस्याग्रस्त हो सकता है, क्योंकि परख किए जा रहे क्रोमैटिन के एक बड़े हिस्से को कृत्रिम गुणसूत्र के रूप में कैप्चर किया जाना चाहिए और 3 सी नमूनों के साथ संसाधित किया जाना चाहिए। इस तरह के निर्माण को सुरक्षित करना संभव नहीं हो सकता है, और एक बनाना एक सेमेस्टर परियोजना के दायरे से बाहर हो सकता है। इन कठिनाइयों के कारण, हम एक नियंत्रण प्राइमर का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। नियंत्रण प्राइमर “नियंत्रण टेम्पलेट” की सभी कार्यक्षमता को प्रतिस्थापित नहीं करता है, लेकिन फिर भी “उपस्थिति” या “अनुपस्थिति” निर्धारण करने के लिए डेटा का विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है।
क्यूपीसीआर करते समय, नमूने की समान मात्रा का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। यह निर्धारित किया जाना चाहिए, भले ही नैनो-स्पेक्ट्रोफोटोमीटर जैसे कि नैनोड्रॉप का उपयोग करके, एक ज्ञात एकाग्रता के जीनोमिक डीएनए से एक मानक वक्र उत्पन्न करके और 3 सी नमूनों को उस लाइन में फिट करके। इन राशियों को दर्ज किया जाना चाहिए और बाद के पीसीआर में उपयोग किया जाना चाहिए। पीसीआर प्रतिक्रिया की गुणवत्ता भी महत्वपूर्ण है। जैसा कि पीसीआर क्यूपीसीआर में चलता है, उत्पाद बहुतायत को प्रतिदीप्ति का उपयोग करके मापा जाता है और दर्ज किया जाता है। यह रिकॉर्डिंग प्रवर्धन प्लॉट में सुलभ है। एक बार कार्यक्रम समाप्त हो जाने के बाद, प्रवर्धन प्लॉट की जांच करना और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रतिक्रियाओं (नो टेम्प्लेट नियंत्रण को छोड़कर) में तीन चरण हैं: एक बेसलाइन, एक घातीय, और एक पठार / संतृप्ति चरण। यह जांचना महत्वपूर्ण है कि प्रतिक्रियाओं में एक घातीय चरण है, विशेष रूप से दहलीज निर्धारित करने के लिए (नीचे देखें)। इसके अतिरिक्त, क्रमिक रूप से पतला नमूनों के लिए, नमूने के कमजोर पड़ने के अनुरूप सीटी मूल्यों में बदलाव होना चाहिए (उच्चतम एकाग्रता में सबसे कम सीटी मान होंगे, जबकि सबसे कम एकाग्रता में उच्चतम सीटी मान होंगे)। नमूने जो प्रवर्धन प्लॉट में इस परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, उन्हें एक नए कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है या 3 सी नमूना गठन के साथ एक बड़े मुद्दे का संकेत मिलता है। अंत में, मानक वक्र उत्पन्न करते समय, पीसीआर सॉफ्टवेयर पीसीआर दक्षता और आर2 मान की गणना करेगा। पीसीआर दक्षता 90% से अधिक होनी चाहिए, और आर2 मान 0.99 से अधिक होना चाहिए। यदि इनमें से कोई भी शर्त पूरी नहीं होती है, तो यह संभावना है कि नमूना या पीसीआर प्राइमरों के साथ कुछ गलत है।
क्यूपीसीआर के बाद, प्रतिशत पाचन और 3 सी इंटरैक्शन की उपस्थिति की गणना प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए क्यूपीसीआर सीटी का उपयोग करके की जा सकती है। इन्हें निर्धारित करने के लिए, सबसे पहले, पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए सीमा निर्धारित की जानी चाहिए। यह आमतौर पर क्यूपीसीआर मशीन के साथ आने वाले सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है। सीमा निर्धारित करने से पीसीआर उत्पाद की एकाग्रता परिभाषित होगी जिसका उपयोग नमूना सीटी मानों की तुलना करने के लिए किया जाएगा। सीमा को प्रवर्धन के घातीय चरण में पीसीआर प्रतिक्रियाओं के प्रवर्धन वक्रों को विभाजित करना चाहिए। घातीय प्रवर्धन के साथ केवल पीसीआर प्रतिक्रियाओं की तुलना की जा सकती है (इस मामले में, नियंत्रण प्राइमर और परीक्षण प्राइमर प्रतिक्रियाएं), क्योंकि यह सुनिश्चित करने का एकमात्र तरीका है कि प्रतिक्रियाएं डीएनए को एक ही दर से बढ़ा रही हैं और ईमानदारी से तुलना की जा सकती है। 3 सी ग्राफ़ का विश्लेषण करते समय, सशर्त रूप से सकारात्मक प्रतिक्रियाओं को नियंत्रण नमूनों, जीनोमिक नियंत्रण और पाचन नियंत्रण (चित्रा 4 बी) पर अधिक उत्पाद वाले लोगों के रूप में पहचाना जाता है। हालांकि, पीसीआर उत्पाद के जेल शुद्धिकरण के बाद सेंगर अनुक्रमण का उपयोग करके इन नमूनों को और मान्य किया जाना चाहिए।
सेंगर अनुक्रमण के बाद, क्यूसी पास करने वाले नमूनों का विश्लेषण ब्लैट का उपयोग करके किया जा सकता है। इस विश्लेषण का लक्ष्य यह निर्धारित करना है कि क्या नमूने में प्रतिबंध साइट (इस प्रोटोकॉल के मामले में डीपीएनआईआई) के फ्लैंक वाले लक्ष्य जीनोमिक लोकी दोनों का अनुक्रम है। यदि दोनों अनुक्रमों की पहचान की जाती है, तो 3 सी टुकड़े को मान्य माना जा सकता है। यदि ब्लैट के परिणाम अपेक्षित अनुक्रम को वापस नहीं करते हैं, तो यह संकेत दे सकता है कि एक या दोनों प्राइमर इष्टतम नहीं हैं, जिसके परिणामस्वरूप गलत सकारात्मक क्यूपीसीआर परिणाम होता है। झूठे सकारात्मक नमूनों के लिए ट्रेस फ़ाइलों में अपरिभाषित आधार शिखर होंगे, और सेक रिपोर्ट में ज्यादातर “एन” बेस कॉल होंगे।
सेंगर सत्यापन आवश्यक है, क्योंकि कृत्रिम पीसीआर उत्पाद गठन से झूठी सकारात्मकता संभव है। इन झूठे सकारात्मक ों की पहचान तब की जा सकती है जब अनुक्रमण उत्पादों में अपेक्षित लक्ष्य अनुक्रम या उचित 3 सी टुकड़े की डीपीएनआईआई साइट विशेषता नहीं होती है (चित्रा 5)। पीसीआर टुकड़ों का अनुक्रमण प्रयोग के लिए एक और डेटा बिंदु भी प्रदान करता है और छात्रों को बताता है कि 3 सी तकनीक दूर के जीनोमिक लोकी की पहचान कर रही है जो नाभिक के भीतर 3 डी स्पेस में एक साथ आ रहे हैं।
3 सी तकनीक एक लचीली, सीधी प्रक्रिया में स्नातक के लिए मूलभूत आणविक तकनीकों का खजाना प्रदान करती है। यह 3 सी तकनीक अन्य 3 सी तकनीकों के लिए एक लॉन्चिंग पॉइंट भी है जिसमें अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) शामिल हैं। इस प्रकार के प्रयोग जैव सूचना विज्ञान के महत्वपूर्ण पहलुओं के लिए स्नातक को उजागर कर सकते हैं और यहां उल्लिखित बुनियादी सिद्धांतों में निहित हैं। स्नातक अनुभव और भागीदारी युवा वैज्ञानिकों के रूप में उनकी सफलता और विकास की कुंजी है। इन अवसरों को प्रदान करके, स्नातक अत्याधुनिक तकनीकों और प्रश्नों से निपटने के लिए अपने आत्मविश्वास का निर्माण करते हुए बुनियादी सिद्धांतों की अपनी समझ को मजबूत कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को अनुदान संख्या P20GM103430 और ब्रायंट सेंटर ऑफ हेल्थ एंड बिहेवियरल साइंसेज के तहत नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज से रोड आइलैंड इंस्टीट्यूशनल डेवलपमेंट अवार्ड (आईडीईए) नेटवर्क ऑफ बायोमेडिकल रिसर्च एक्सीलेंस द्वारा समर्थित किया गया था।
37% Formaldehyde | Millapore-Sigma | F8775 | |
100% Ethanol | Millapore-Sigma | E7023 | |
CaCl2 | MP Biomedical | 215350280 | |
chloroform | Millapore-Sigma | C0549 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millapore-Sigma | COEDTAF-RO | mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
Dithiothreitol (DTT) | Millapore-Sigma | D0632 | 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
DpnII | NEB | R0543M | |
Glycerol | Millapore-Sigma | G9012 | |
glycine | Millapore-Sigma | G8898 | |
glycogen | Millapore-Sigma | 10901393001 | |
HEPES | Millapore-Sigma | H3375 | |
KCl | Millapore-Sigma | P3911 | |
KH2PO4 | Millapore-Sigma | P5655 | |
methyl green pyronin | Millapore-Sigma | HT70116 | |
MgAc2 | Thermoscientific | 1222530 | |
Na2HPO4 | Millapore-Sigma | S5136 | |
NaCl | Millapore-Sigma | S9888 | |
phenol-chloroform | Millapore-Sigma | P3803 | |
Pronase | Millapore-Sigma | 11459643001 | |
Proteinase K | IBI Scientific | IB05406 | |
qPCR Ready mix (Phire Taq etc) | Millapore-Sigma | KCQS07 | |
RNase A | Millapore-Sigma | R6148 | |
Sodium Acetate | Millapore-Sigma | S2889 | |
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Millapore-Sigma | L3771 | |
Sucrose | Millapore-Sigma | S0389 | |
T4 DNA Ligase | Promega | M1804 | |
Tris-HCl | Millapore-Sigma | 108319 | |
Triton X-100 | Millapore-Sigma | T9284 | |
Trypsin-EDTA | Millapore-Sigma | T4049 |