Caratterizzazione dei trasportatori di zinco nei mammiferi mediante un saggio di trasporto dello zinco in vitro

Summary

Il trasporto dello zinco si è dimostrato difficile da misurare a causa dei deboli legami causali con la funzione proteica e della bassa risoluzione temporale. Questo protocollo descrive un metodo per monitorare, con alta risoluzione temporale, l’estrusione di Zn 2+ da cellule viventi utilizzando un colorante fluorescente sensibile allo Zn 2+, fornendo così una misura diretta dell’efflusso di Zn²⁺.

Abstract

I metalli di transizione come gli ioni Zn²⁺ devono essere strettamente regolamentati a causa della loro tossicità cellulare. In precedenza, l’attività dei trasportatori di Zn 2+ veniva misurata indirettamente determinando il livello di espressione del trasportatore sotto diverse concentrazioni di Zn²⁺. Ciò è stato fatto utilizzando l’immunoistochimica, misurando l’mRNA nel tessuto o determinando i livelli cellulari di Zn²⁺. Con lo sviluppo di sensori intracellulari di Zn 2+, le attività dei trasportatori di zinco sono attualmente determinate principalmente correlando i cambiamenti intracellulari di Zn 2+, rilevati utilizzando sonde fluorescenti, con l’espressione dei trasportatori di Zn²⁺. Tuttavia, ancora oggi, solo pochi laboratori monitorano i cambiamenti dinamici nello Zn²⁺ intracellulare e lo utilizzano per misurare direttamente l’attività dei trasportatori di zinco. Parte del problema è che dei 10 trasportatori di zinco della famiglia ZnT, ad eccezione di ZnT10 (trasporta manganese), solo il trasportatore di zinco 1 (ZnT1) è localizzato sulla membrana plasmatica. Pertanto, è difficile collegare l’attività di trasporto ai cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Zn²⁺. Questo articolo descrive un modo diretto per determinare la cinetica di trasporto dello zinco utilizzando un saggio basato su un colorante fluorescente specifico per lo zinco, FluoZin-3. Questo colorante viene caricato nelle cellule di mammifero nella sua forma estere e quindi intrappolato nel citosol a causa dell’attività della diesterasi cellulare. Le cellule sono caricate con Zn 2+ utilizzando lo ionoforo Zn²⁺ piritione. L’attività di ZnT1 è valutata dalla parte lineare della riduzione della fluorescenza a seguito del washout cellulare. La fluorescenza misurata ad un’eccitazione di 470 nm e un’emissione di 520 nm è proporzionale allo Zn²⁺ intracellulare libero. La selezione delle cellule che esprimono ZnT1 marcate con il fluoroforo mCherry consente di monitorare solo le cellule che esprimono il trasportatore. Questo saggio viene utilizzato per studiare il contributo di diversi domini della proteina ZnT1 al meccanismo di trasporto della ZnT1 umana, una proteina eucariotica transmembrana che estrude lo zinco in eccesso dalla cellula.

Introduction

Lo zinco è un oligoelemento essenziale nell’ambiente cellulare. Incorpora un terzo di tutte le proteine ed è coinvolto in vari processi cellulari, come la catalisi¹, la trascrizione² e i motivi strutturali³. Tuttavia, nonostante sia redox-inerte, alte concentrazioni di zinco sono tossiche per la cellula, motivo per cui nessun organismo di mammifero è sopravvissuto senza la presenza di meccanismi che regolano l’omeostasi dello zinco. Nei mammiferi, tre meccanismi sono responsabili di questo processo: (1) metallotioneine, che sono proteine citosoliche ricche di cisteina che legano lo zinco ad un’elevata affinità, prevenendo così l’eccesso di zinco citosolico libero⁴; (2) Proteine Zrt/Irt-like (ZIPs), che sono trasportatori di zinco responsabili dell’afflusso di zinco nel citosol attraverso la membrana plasmatica o dagli organelli intracellulari 4,5,6,7,8; e (3) ZnT, che sono un sottoinsieme di mammiferi della famiglia dei facilitatori di diffusione cationica ubiquitaria (CDF) e sono trasportatori di zinco, in quanto estrudono lo zinco dal citosol attraverso la membrana plasmatica o negli organelli intracellulari 4,5,6,7,8,9. A causa dell’importanza dello zinco per il metabolismo cellulare, è fondamentale comprendere le dinamiche cellulari dello zinco.

I metodi precedenti per valutare la dinamica dello zinco dipendevano dalla valutazione dei livelli di espressione dell’mRNA in diverse condizioni di zinco, correlandoli con le misurazioni cellulari dello zinco di tessuti o cellule fisse^10,11,12. Questi metodi includono il rilevamento chimico e la colorazione immunoistochimica. Tuttavia, questi metodi forniscono solo misure indirette e, quindi, determinano solo una correlazione offline tra la concentrazione intracellulare di zinco e l’espressione dei trasportatori di zinco. Di conseguenza, questi metodi non possono dedurre alcun parametro che richieda un’elevata risoluzione temporale.

Una misurazione più diretta del trasporto di Zn²⁺ utilizza isotopi radioattivi dello zinco¹³. Questo metodo si basa sulla misurazione dello Zn²⁺ radiomarcato per monitorare il trasporto dello zinco e la sua cinetica. Tuttavia, a causa dell’importanza dello zinco per l’omeostasi cellulare, molteplici processi cellulari regolano la concentrazione intracellulare di zinco. Tra questi ci sono il legame extracellulare e diversi sistemi di trasporto che lavorano di concerto per mantenere uno stretto controllo dei livelli intracellulari di Zn²⁺ . La combinazione di questi processi crea un notevole rumore di fondo, che rende difficile testare le singole funzioni di trasporto legate allo zinco.

Questo articolo illustra un metodo per monitorare direttamente la velocità di trasporto dello zinco misurando la concentrazione intracellulare di zinco libero utilizzando un colorante fluorescente specifico per lo zinco, FluoZin-3. Il colorante ha un’elevata specificità per Zn²⁺ e poca interferenza da altri cationi bivalenti, come il calcio. Inoltre, nella sua forma estere, entra nelle cellule per diffusione non ionica e viene quindi intrappolato a causa dell’attività della diesterasi intracellulare. Pertanto, la sua fluorescenza è correlata principalmente con la concentrazione di zinco citosolico libero. Questi esperimenti sono stati condotti per studiare la relazione struttura-funzione del trasportatore di zinco 1 (ZnT1), un membro della famiglia ZnT.

Protocol

1. Trasfezione cellulare Coltura di cellule HEK293T in terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina e 1x penicillina/streptomicina (vedi Tabella dei materiali) in un incubatore umidificato a 37 °C/5% CO2 fino alla confluenza su una piastra di 10 cm (8,8 x 106 cellule totali). Posizionare un vetrino coprioggetto da 13 mm in ciascuno dei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. D…

Representative Results

ZnT1 è un trasportatore di zinco dei mammiferi situato sulla membrana plasmatica cellulare13. È un membro della famiglia delle proteine facilitatore della diffusione cationica (CDF) che estrude lo zinco dal citosol al millieu14 extracellulare. ZnT1 ha un’architettura a due domini: il dominio transmembrana, che trasporta gli ioni attraverso la membrana, e un dominio C-terminale14. A differenza di altre proteine CDF conosciute, ZnT1 ha un dominio C-t…

Discussion

Il metodo sopra descritto consente la misurazione diretta della concentrazione intracellulare di zinco con un’elevata risoluzione temporale. Rispetto ad altri metodi, questo metodo che prevede il monitoraggio dei cambiamenti nello Zn²⁺ intracellulare può ridurre sostanzialmente il rumore di fondo. Inoltre, la selettività del colorante per lo zinco elimina le potenziali interazioni incrociate con altri cationi metallici^18,19. Infine, la sua mancanza d…

Materials

10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665