İn Vitro Çinko Taşıma Testi Kullanılarak Memeli Çinko Taşıyıcılarının Karakterize Edilmesi
Summary
Çinko taşınmasının, protein fonksiyonuna zayıf nedensel bağlantılar ve düşük zamansal çözünürlük nedeniyle ölçülmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, Zn 2 + duyarlı bir floresan boya kullanarak canlı hücrelerden Zn2 + ekstrüzyonunu yüksek zamansal çözünürlükle izlemek için bir yöntemi açıklar, böylece doğrudan bir Zn2 + akışı ölçümü sağlar.
Abstract
Zn2+ iyonları gibi geçiş metalleri, hücresel toksisiteleri nedeniyle sıkı bir şekilde düzenlenmelidir. Daha önce, Zn2+ taşıyıcılarının aktivitesi, farklı Zn2+ konsantrasyonları altında taşıyıcının ekspresyon seviyesi belirlenerek dolaylı olarak ölçülüyordu. Bu, immünohistokimya kullanılarak, dokudaki mRNA’yı ölçerek veya hücresel Zn2+ seviyelerini belirleyerek yapıldı. Hücre içi Zn2+ sensörlerinin geliştirilmesiyle, çinko taşıyıcıların aktiviteleri şu anda esas olarak, floresan problar kullanılarak tespit edilen hücre içi Zn 2 + ‘daki değişikliklerin Zn2 + taşıyıcılarının ekspresyonu ile ilişkilendirilmesiyle belirlenmektedir. Bununla birlikte, bugün bile, sadece birkaç laboratuvar hücre içi Zn2 + ‘daki dinamik değişiklikleri izlemekte ve bunu çinko taşıyıcılarının aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanmaktadır. Sorunun bir kısmı, ZnT ailesinin 10 çinko taşıyıcısından, ZnT10 (manganez taşır) hariç, plazma zarında sadece çinko taşıyıcı 1’in (ZnT1) lokalize olmasıdır. Bu nedenle, taşıma aktivitesini hücre içiZn2+ konsantrasyonundaki değişikliklere bağlamak zordur. Bu makale, çinkoya özgü bir floresan boya olan FluoZin-3’e dayalı bir tahlil kullanarak çinko taşıma kinetiğini belirlemenin doğrudan bir yolunu açıklamaktadır. Bu boya, ester formunda memeli hücrelerine yüklenir ve daha sonra hücresel diesteraz aktivitesi nedeniyle sitozolde tutulur. Hücreler, Zn2+ iyonofor pirityonu kullanılarak Zn2+ ile yüklenir. ZnT1 aktivitesi, hücre yıkamasını takiben floresanstaki azalmanın doğrusal kısmından değerlendirilir. 470 nm’lik bir uyarılmada ve 520 nm’lik bir emisyonda ölçülen floresan, serbest hücre içi Zn2+ ile orantılıdır. mCherry florofor ile etiketlenmiş ZnT1’i eksprese eden hücrelerin seçilmesi, yalnızca taşıyıcıyı eksprese eden hücrelerin izlenmesine izin verir. Bu test, ZnT1 proteininin farklı alanlarının, hücreden fazla çinko ekstrüde eden ökaryotik bir transmembran proteini olan insan ZnT1’in taşıma mekanizmasına katkısını araştırmak için kullanılır.
Introduction
Çinko, hücresel ortamda önemli bir eser elementtir. Tüm proteinlerin üçte birini içerir ve kataliz1, transkripsiyon2 ve yapısal motifler3 gibi çeşitli hücresel süreçlerde yer alır. Bununla birlikte, redoks-inert olmasına rağmen, yüksek çinko konsantrasyonları hücre için toksiktir, bu nedenle çinko homeostazını düzenleyen mekanizmaların varlığı olmadan hiçbir memeli organizması hayatta kalmamıştır. Memelilerde bu süreçten üç mekanizma sorumludur: (1) çinkoyu yüksek afinitede bağlayan sitozolik sistein açısından zengin proteinler olan metallotiyoninler, böylece aşırı serbest sitozolik çinko4; (2) Plazma zarı yoluyla veyahücre içi organellerden 4,5,6,7,8 sitozole çinko akışından sorumlu çinko taşıyıcıları olan Zrt/Irt benzeri proteinler (ZIP’ler); ve (3) Her yerde bulunan katyon difüzyon kolaylaştırıcı (CDF) ailesinin memeli bir alt kümesi olan ve çinkoyu sitozolden plazma zarı boyunca veya hücre içi organellere 4,5,6,7,8,9 ekstrüde ettikleri için çinko taşıyıcıları olan ZnT’ler. Çinkonun hücresel metabolizma için önemi nedeniyle, hücresel çinko dinamiklerini anlamak hayati önem taşır.
Çinko dinamiklerini değerlendirmeye yönelik önceki yöntemler, farklı çinko koşulları altında mRNA’nın ekspresyon düzeylerinin, sabit dokuların veya hücrelerin hücresel çinko ölçümleri ile ilişkilendirilerek değerlendirilmesine dayanıyordu10,11,12. Bu yöntemler arasında kimyasal tespit ve immünohistokimya boyama yer alır. Bununla birlikte, bu yöntemler yalnızca dolaylı ölçümler sağlar ve bu nedenle, hücre içi çinko konsantrasyonu ile çinko taşıyıcılarının ekspresyonu arasında yalnızca çevrimdışı bir korelasyon belirler. Sonuç olarak, bu yöntemler yüksek zamansal çözünürlük gerektiren herhangi bir parametreyi çıkaramaz.
Zn2+ taşınmasının daha doğrudan bir ölçümü, çinko13’ün radyoaktif izotoplarını kullanır. Bu yöntem, çinko taşınmasını ve kinetiğini izlemek için radyoaktif işaretli Zn2 + ölçümüne dayanır. Bununla birlikte, çinkonun hücresel homeostaz için önemi nedeniyle, çoklu hücresel süreçler hücre içi çinko konsantrasyonunu düzenler. Bunlar arasında hücre dışı bağlanma ve hücre içi Zn2+ seviyelerinin sıkı kontrolünü sağlamak için uyum içinde çalışan çeşitli taşıma sistemleri vardır. Bu işlemlerin kombinasyonu, çinko ile ilgili bireysel taşıma işlevlerinin test edilmesini zorlaştıran önemli bir arka plan gürültüsü oluşturur.
Bu makale, çinkoya özgü bir floresan boya olan FluoZin-3 kullanılarak hücre içi serbest çinko konsantrasyonunu ölçerek çinko taşıma hızını doğrudan izlemek için bir yöntemi göstermektedir. Boya, Zn2+ için yüksek özgüllüğe ve kalsiyum gibi diğer iki değerlikli katyonlardan çok az etkileşime sahiptir. Ek olarak, ester formunda, iyonik olmayan difüzyon yoluyla hücrelere girer ve daha sonra hücre içi di-esterazın aktivitesi nedeniyle tutulur. Bu nedenle, floresansı esas olarak serbest sitozolik çinko konsantrasyonu ile ilişkilidir. Bu deneyler, ZnT ailesinin bir üyesi olan çinko taşıyıcı 1’in (ZnT1) yapı-fonksiyon ilişkisini incelemek için yapılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda tarif edilen yöntem, hücre içi çinko konsantrasyonunun yüksek zamansal çözünürlükle doğrudan ölçülmesine izin verir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, hücre içi Zn2+‘daki değişikliklerin izlenmesini içeren bu yöntem, arka plan gürültüsünü önemli ölçüde azaltabilir. Ek olarak, boyanın çinko için seçiciliği, diğer metal katyonlarla potansiyel çapraz etkileşimleriortadan kaldırır 18,19. Son …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raz Zarivach, İsrail Bilim Vakfı tarafından desteklenmektedir (hibe no. 163/22). Tomer, Eli Ben Yosef ve Arie Moran, İsrail Bilim Vakfı tarafından desteklenmektedir (hibe no. 2047/20). Daniel Gitler ve Ben-Gurion Üniversitesi’ndeki grubuna işbirlikleri, destekleri ve uzmanlıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters – A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer’s disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer’s disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d., Findley, S. d. Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
