Vi beskriver en protokoll for å isolere murin, små tarmkrypter og dyrkning av intestinale 3D-organoider fra kryptene. I tillegg beskriver vi en metode for å generere organoider fra en enkelt intestinal stamcelle i fravær av en sub-epitelial cellulær nisje.
I dag representerer organoiddyrkning et viktig verktøy for in vitro-studier av ulike biologiske aspekter og sykdommer i ulike organer. Murine små tarmkrypter kan danne organoider som etterligner tarmepitelet når de dyrkes i en 3D ekstracellulær matrise. Organoidene er sammensatt av alle celletyper som oppfyller ulike intestinale homeostatiske funksjoner. Disse inkluderer Paneth-celler, enteroendokrine celler, enterocytter, bobleceller og tuftceller. Velkarakteriserte molekyler tilsettes i kulturmediet for å berike tarmstamceller (ISC) merket med leucinrike repetisjoner som inneholder G-proteinkoblet reseptor 5 og brukes til å drive differensiering ned spesifikke linjer; disse molekylene inkluderer epidermal vekstfaktor, Noggin (et benmorfogenetisk protein) og R-spondin 1. I tillegg er en protokoll for å generere organoider fra en enkelt erytropoietinproduserende hepatocellulær reseptor B2 (EphB2) -positiv ISC også detaljert. I denne metodeartikkelen beskrives teknikker for å isolere små tarmkrypter og en enkelt ISC fra vev og sikre effektiv etablering av organoider.
Intestinale organoider, som først ble etablert i 2009, har dukket opp som et kraftig in vitro-verktøy for å studere tarmbiologi gitt deres morfologiske og funksjonelle likhet med modne vev. Nylig har teknologiske fremskritt i dyrkede organoider avledet fra stamceller fra voksenvev gjort det mulig for den langsiktige kulturen av intestinale stamceller (ISC) med selvfornyelses- og differensieringspotensial. Disse organoider har blitt mye brukt for grunnleggende og translasjonelle forskningsstudier på gastrointestinal fysiologi og patofysiologi 1,2,3,4,5,6. 3D-organoidene utviklet av Clevers-gruppen gir et kraftig verktøy for å studere tarmepitelet med forbedret fysiologisk relevans7. Siden intestinale organoider er avledet fra vevsstamceller og består av flere celletyper, rekapitulerer de funksjonaliteten til tarmepitelet. Merk at en enkeltsortert leucinrik repetisjon som inneholder G-proteinkoblet reseptor 5-positiv (Lgr5 +) stamcelle også kan generere 3D-organoider uten Paneth-celler eller en ISC-nisje som epitelnisje eller stromalnisje7. Imidlertid er den organoiddannende kapasiteten til enkeltsorterte Lgr5+-celler lav sammenlignet med krypten og ISC-Paneth-celledublettene8.
Et økende antall studier har vist at metodene for inkubasjon av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) eller kollagenasedissosiasjon forårsaker løsning i epitelet og frigjøring av krypter. Siden enzymatisk dissosiasjon kan ha en effekt på celletilstanden til krypter, brukes vanligvis en mekanisk isolasjonsmetode for å dissociere vevet. Selv om mekanisk fordøyelse er en rask teknikk, kan denne metoden være forbundet med inkonsekvente kryptutbytter eller dårlig celle levedyktighet9. Derfor kan EDTA-behandling og mekanisk dissosiasjon kombineres for å generere bedre kryptutbytter. Et trekk ved metodikken vist i denne artikkelen er bruken av kraftig risting av vevfragmentene etter EDTA-kelering10. Kraftig risting tillater effektiv isolering av krypter fra krypt-villuskomplekser i tynntarmen. Graden av manuell risting bestemmer separasjonen. Dermed er det viktig å skaffe krypter fra komplekser for eksperimenter på dette feltet. I tillegg kan riktig dyktighet redusere villusforurensning til et minimum og øke antall krypter.
Derfor kan denne eksperimentelle protokollen, som benytter murine-avledede små tarmorganoider, bedre isolere krypter med fysisk kraft etter behandling med EDTA for dissosiasjon. Det er kjent at ekspresjonsmønsteret til erytropoietinproduserende hepatocellulær reseptor B2 (EphB2) delvis gjenspeiler kryptmiljøet. For eksempel er EphB2-positive celler organisert fra bunn til topp11. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) ble utført basert på EphB2-ekspresjonen, og de oppnådde cellene ble delt inn i fire grupper: EphB2høy, EphB2med, EphB2lav og EphB2neg. Deretter ble organoidveksten fra enkeltsorterte EphB2høye celler i villtype (WT) mus demonstrert.
Denne protokollen beskriver en metode for konsekvent isolering av små tarmkrypter og den påfølgende kulturen av 3D-organoider. For å forbedre kryptfrigivelseshastigheten ble det etablert en mekanisk isolasjonsmetode som involverte kraftig risting etter behandling med EDTA. Mediesammensetningen er forskjellig fra den opprinnelige protokollen til Sato et al.7. Det opprinnelige mediet er relativt kostbart. Det er derfor vist et dyrkningsmedium og tilpassede medier for små tarmorganoider som inneholder farmakologiske hemmere, rekombinante vekstfaktorer og/eller betingede medier i tabell 1. Wnt3A og N-acetylcystein er ikke inkludert i dyrkningsmediet i denne protokollen. Som Paneth-celler uttrykker Wnt3, produserer cellene Wnt3 og støtter ISC-vedlikehold. I tillegg, i løpet av kryptisolasjon, brukes ikke det betingede mediet. Den organoide modellen er dynamisk og har cellulær og strukturell heterogenitet (Paneth-celler, enterocytter, begerceller, enteroendokrine celler, tuftceller og ISC-er). Derfor kan disse organoidene brukes i stor skala for å studere grunnleggende spørsmål om organoidbiologi.
EphB2-gradienten opprettholder ISC-stamme og proliferasjon langs krypt-villus-aksen i den voksne tynntarmen18. Fordelen med å lage organoider fra en enkelt EphB2-celle sammenlignet med isolerte krypter er relatert til å forstå biologien til murine ISC, da ISC-er spiller nøkkelroller i ulike humane tarmlidelser. Enkle EphB2høyuttrykkende ISC-er kan dyrkes for å danne organoider på samme måte som utviklingen av organoider fra enkle Lgr5-uttrykkende ISC-er. Det viktigste trinnet er å nøyaktig dele cellene i fire grupper (EphB2høy, EphB2med, EphB2lav og EphB2neg) i henhold til EphB2-uttrykket i kryptene ved hjelp av FACS. Forward versus side scatter (FSC vs. SSC) plott brukes ofte til å identifisere celler av interesse basert på deres størrelse og granularitet. FSC indikerer cellestørrelsen, og SSC relaterer seg til kompleksiteten eller granulariteten til cellen i P0-porten (figur 2A). I dette arbeidet ble cellene som falt innenfor den definerte porten (P0) senere analysert for levedyktighet. Deretter ble deres levedyktighet bestemt i henhold til de negative og positive populasjonene av 7-AAD fluorescenssignaler. Grensen mellom de 7-AAD-negative og -positive cellene ble strengt bestemt for å få de negative med minimal positiv celleforurensning. EphB2-portene ble grovt sett basert på EphB2-gradert uttrykk.
For å bekrefte at de fire gruppene var nøyaktig delt, ble mRNA-uttrykket av utvalgte gener analysert. mRNA-nivåene av ISC-markører er høye i EphB2høye celler20. I tillegg er mRNA-nivåene av stamcellespesifikke markører relativt høye i EphB2med celler20. Imidlertid er EphB2-eksdepression i EphB2low og EphB2neg cells lav eller negativ sammenlignet med EphB2høy og EphB2med celler20. De foregående tiltakene bør iverksettes for å sikre anrikning avhøycellepopulasjonen av EphB2 før plating. Imidlertid kan organoid vekst på mindre enn 6% fra EphB2høye celler skyldes død av stamceller under kulturprosessen, ikke kraftig risting under kryptisolasjonen. Det er vist at anvendelsen av en selektiv Rho-assosiert kinase (ROCK)-hemmer på humane embryonale stamceller reduserer dissosiasjonsindusert apoptosemarkant 22. Således, som en teknisk endring, er det verdt å prøve å legge til ROCK-hemmeren ved en høyere konsentrasjon og med en lengre inkubasjon for å forbedre levedyktigheten.
Wnt3A-utskillende Paneth-celler ved siden av ISC-er gir viktig støtte til ISC-ene8. Faktisk viser ISC-Paneth-celledubletter en sterkt økt organoiddannende kapasitet sammenlignet med enkle ISC-er8. Videre har tilsetning av Wnt3A i konsentrasjonen på 100 ng / ml for de første 3 dagene av kultur vist seg å øke organoiddannende kapasitet8. Således, som en annen teknisk endring, kan tilsetning av eksogen Wnt3A forbedre organoiddannende kapasitet av enkelt EphB2høyuttrykkende ISC-er.
Sammenlignet med in vivo-tilnærminger, kan organoider lett brukes til genetisk manipulasjon, analyse av malignitetsfenotyper og medikamentscreening20,23. En kombinasjon av EDTA-kelering og en mekanisk isolasjonsmetode er effektiv, reproduserbar og tidseffektiv for å lage små tarmorganoider fra krypter og kan lett følges av laboratoriepersonell uten avansert erfaring. Dermed kan tillegg av den mekaniske isolasjonen med kraftig risting etter behandling med EDTA effektivt etablere murine tynntarmsorganoider ex vivo og gi et potensielt verktøy for organoiddyrking og sykdomsmodellering av andre voksne epitelvev.
Intestinale epitelceller er polariserte og orienterte med den apikale siden rettet mot lumen. Imidlertid er den apikale siden som vender mot lumen av 3D-organoider i deres indre. Dermed forhindrer denne organisasjonen tilgang til den apikale siden, noe som er et problem når man studerer effekten av luminalkomponenter, som næringsstoffer, mikrober og metabolitter på epitelceller. For å omgå denne ulempen er det utviklet en kultur av organoide celler som 2D-monolag24. Når det gjelder fremtidige applikasjoner, vil kulturen av organoidcellemonolag bli utnyttet, da dette representerer det mest effektive og håndterbare systemet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for Scientific Research (C) til TT (tilskuddsnummer JP17K07495 og JP20K06751). Vi takker professor Mineko Kengaku for bruk av utstyr for langtidsavbildning (LCV100; Olympus).
1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |