रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं की जांच के लिए मेथनॉल-आधारित होल-माउंट तैयारी
Summary
मेथनॉल का उपयोग रेटिना होल-माउंट तैयारी और दीर्घकालिक भंडारण के लिए एक सहायक निश्चित माध्यम के रूप में किया जा सकता है, जो रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं की जांच के लिए उपयोगी है।
Abstract
रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं (आरजीसी), जो रेटिना के प्रक्षेपण न्यूरॉन्स हैं, मस्तिष्क को बाहरी दृश्य जानकारी का प्रसार करती हैं। आरजीसी में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का कई रेटिना अपक्षयी रोगों के साथ घनिष्ठ संबंध है। रेटिना के विकास और रोग संबंधी स्थितियों का मूल्यांकन करने के लिए आरजीसी पर प्रयोगात्मक अध्ययनों में होल-माउंट रेटिना इम्यूनोस्टेनिंग का अक्सर उपयोग किया जाता है। कुछ परिस्थितियों में, कुछ मूल्यवान रेटिना नमूने, जैसे कि ट्रांसजेनिक चूहों से, आकृति विज्ञान या आरजीसी की संख्या को प्रभावित किए बिना लंबे समय तक बनाए रखने की आवश्यकता हो सकती है। विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक परिणामों के लिए, एक प्रभावी संरक्षण माध्यम का उपयोग करना आवश्यक है। यहां, हम रेटिना पूरे-माउंट तैयारी और दीर्घकालिक भंडारण के लिए एक सहायक निश्चित माध्यम के रूप में मेथनॉल के प्रभाव का वर्णन करते हैं। संक्षेप में, अलगाव प्रक्रिया के दौरान, ठंडे मेथनॉल (−20 डिग्री सेल्सियस) को ऊतकों को ठीक करने और उनकी पारगम्यता को सुविधाजनक बनाने में मदद करने के लिए रेटिना की सतह पर पाइप किया जाता है, और फिर रेटिना को इम्यूनोस्टेन्ड होने से पहले ठंडे मेथनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस) में संग्रहीत किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल रेटिना अलगाव वर्कफ़्लो और ऊतक नमूना भंडारण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो आरजीसी की जांच के लिए उपयोगी और व्यावहारिक है।
Introduction
रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं (आरजीसी) रेटिना में एकमात्र प्रक्षेपण न्यूरॉन्स हैं, औरवे मस्तिष्क 1 के बाहर दृश्य जानकारी को एकीकृत और संचारित करते हैं। ग्लूकोमा और दर्दनाक ऑप्टिक न्यूरोपैथी जैसे कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को अपरिवर्तनीय क्षति और आरजीसी 2,3 के नुकसान की विशेषता है। आरजीसी के रूपात्मक और मात्रात्मक परिवर्तनों का विश्लेषण यह निर्धारित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है कि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग कैसे विकसित होते हैं और 4,5 को आगे बढ़ाते हैं।
अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख प्रोटीन और सेल गिनती के वितरण की निगरानी के लिए एक व्यापक रूप से स्वीकृत विधि है। प्रयोगशाला में, रेटिना6 की शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों का मूल्यांकन करने के लिए आरजीसी पर प्रयोगात्मक अध्ययनों में आमतौर पर होल-माउंट रेटिना इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग किया जाता है। पूरे रेटिना में आरजीसी परिमाणीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम मार्करों में बीआरएन 3 ए, मल्टीपल स्प्लिसिंग (आरबीपीएमएस) के साथ आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन शामिल हैं, और इसी तरह 7,8 पर। आरजीसी की मात्रा और वितरण को चिह्नित करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले पूरे माउंट रेटिना इम्यूनोस्टेनिंग की आवश्यकता होती है। आम तौर पर, इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल में, एंटीबॉडी में इनक्यूबेट होने से पहले रेटिना को रासायनिक फिक्सेटिव में डुबोया जाता है। आदर्श फिक्सेटिव को कोशिकाओं के आकार, एंटीबॉडी के लिए एपिटोप्स की पहुंच या आत्मीयता, या ऊतक 9,10 के रैखिक आयामों को नहीं बदलना चाहिए।
रेटिना की जटिल संरचना के कारण, रेटिना नाजुकता और तह जैसी समस्याएं, साथ ही सेल संकोचन और अस्पष्ट नाभिक सहित कुछ सामान्य कठिनाइयां, पूरे माउंट रेटिना पैच बनाते समय होने की संभावना होती है, जिसका प्रयोगात्मक अनुसंधान पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, सभी रेटिना तुरंत इम्यूनोस्टेन्ड नहीं होते हैं, खासकर जब यह महंगी कीमतों के साथ ट्रांसजेनिक चूहों के रेटिना की बात आती है जो कीमती मूल के होते हैं, जिससे आगे के उपयोग के लिए अतिरिक्त रेटिना नमूनों के संरक्षण की आवश्यकता होती है।
उपयुक्त फिक्सेटिव समाधान ऊतक को जल्दी से ठीक कर सकता है, ऊतक ऑटोलिसिस से बच सकता है, ऊतक कोशिकाओं की सामान्य आकृति विज्ञान और संरचना को संरक्षित कर सकता है, और प्रोटीन औरअन्य पदार्थों की एंटीजेनिसिटी को बनाए रख सकता है। वर्तमान में, फॉर्मलाडेहाइड-आधारित निर्धारण का व्यापक रूप से विभिन्न ऊतकों में उपयोग किया जाता है, जिसमें अलग-अलग रेटिना, हेमीसेक्टेड आईकप और पूरे नेत्रगोलक10 शामिल हैं। फॉर्मलाडेहाइड11 में विसर्जन के बाद ऊतक संकोचन और कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन दो महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं। इसके अलावा, रेटिना और लक्ष्य कोशिकाओं 9,10 के मूल गुणों के प्रतिधारण को अधिकतम करने के लिए संशोधित निर्धारण फॉर्मूलेशन तेजी से उभर रहे हैं। विभिन्न रेटिना निर्धारण उपचार रेटिना संरचना, प्रोटीन इम्युनोजेनेसिटी, प्रतिदीप्ति उत्तेजना और क्षीणन शमन चक्र को अलग-अलग प्रभावित कर सकते हैं। डेविडसन के समाधान के साथ तय किए गए रेटिना फॉर्मेलिन के साथ तय किए गए लोगों की तुलना में अधिक रूपात्मक रूप से बरकरार हैं, लेकिन डेविडसन का समाधान कुछ एंटीबॉडी के साथ कम संगत है, जैसे कि माइक्रोग्लियल मार्कर-आयनित कैल्शियम बाइंडिंग एडाप्टर अणु 112। रेटिना की नाजुक प्रकृति को ध्यान में रखते हुए, शोधकर्ता स्वाभाविक रूप से आश्चर्यचकित होंगे कि क्या रेटिना अखंडता, साथ ही लक्ष्य कोशिकाओं के गुण और आकृति विज्ञान, दीर्घकालिक भंडारण के बाद बदल जाएंगे। हालांकि, कई महीनों तक भंडारण के बाद रेटिना और आरजीसी सेल आकृति विज्ञान पर निर्धारण समाधान के संभावित प्रभाव शायद ही कभी रिपोर्ट किए गए हैं। आरजीसी के मूल्यांकन और संरक्षण के लिए रेटिना निर्धारण का अनुकूलन महत्वपूर्ण है।
हम एक विश्वसनीय और तकनीकी रूप से सरल विधि का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं जिसका उपयोग हम पूरे-माउंट मुराइन रेटिना स्टेनिंग के लिए करते हैं। हमारी विधि आरजीसी जांच के लिए रेटिना की उचित तैयारी और भंडारण पर जोर देती है, रेटिना ऊतक के दीर्घकालिक भंडारण की आवश्यकता के साथ-साथ फ्लोरोफोर गठन या गिरावट के विशिष्ट पहलुओं को ध्यान में रखते हुए।
Protocol
Representative Results
Discussion
रेटिना को संरक्षित करने के लिए निर्धारण एक आवश्यक कदम है, जो आकृति विज्ञान के आधार पर किसी भी बाद की आरजीसी जांच को प्रभावित कर सकता है। सफल निर्धारण तेजी से रेटिना की संरचना और स्थिति को फिक्सिंग माध्य…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को हुबेई की लेबोरेटरीज ओपनिंग प्रोजेक्ट (अनुदान संख्या 2021 केएफवाई 055), हुबेई प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2020सीएफबी 240), और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान निधि (अनुदान संख्या 2042020केएफ0065) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
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