Metanolbaserad helmonteringsberedning för undersökning av retinala ganglieceller
Summary
Metanol kan användas som ett extra fast medium för retinala helmonteringspreparat och långvarig lagring, vilket är användbart för undersökning av retinala ganglionceller.
Abstract
Retinala ganglionceller (RGCs), som är näthinnans projektionsneuroner, sprider extern visuell information till hjärnan. Patologiska förändringar i RGC har ett nära samband med många retinala degenerativa sjukdomar. Helmonterad retinal immunfärgning används ofta i experimentella studier på RGC för att utvärdera näthinnans utvecklings- och patologiska tillstånd. Under vissa omständigheter kan vissa värdefulla näthinneprover, såsom de från transgena möss, behöva behållas under en lång period utan att påverka morfologin eller antalet RGC. För trovärdiga och reproducerbara experimentella resultat är det viktigt att använda ett effektivt konserveringsmedium. Här beskriver vi effekten av metanol som ett extra fast medium för retinala helmonteringspreparat och långtidsförvaring. Kort sagt, under isoleringsprocessen pipetteras kall metanol (−20 °C) på näthinnans yta för att hjälpa till att fixera vävnaderna och underlätta deras permeabilitet, och sedan kan näthinnorna förvaras i kall metanol (−20 °C) innan de immunfärgas. Detta protokoll beskriver arbetsflödet för näthinneisolering och lagringsprotokoll för vävnadsprov, vilket är användbart och praktiskt för undersökning av RGC.
Introduction
Retinala ganglieceller (RGCs) är de enda projektionsneuronerna i näthinnan, och de integrerar och överför extern visuell information till hjärnan1. Många neurodegenerativa sjukdomar som glaukom och traumatisk optisk neuropati kännetecknas av irreversibel skada och förlust av RGC 2,3. Att analysera de morfologiska och kvantitativa förändringarna av RGC är ett avgörande steg för att bestämma hur neurodegenerativa sjukdomar utvecklas och avancerar 4,5.
Indirekt immunofluorescensanalys är en allmänt accepterad metod för att övervaka fördelningen av proteiner och cellräkning. I laboratoriet används helmonterad retinal immunfärgning ofta i experimentella studier på RGC för att utvärdera de fysiologiska och patologiska tillstånden i näthinnan6. De vanligaste markörerna som används för RGC-kvantifiering i hela näthinnan inkluderar Brn3a, RNA-bindande protein med multipel splitsning (RBPMS) och så vidare 7,8. Att karakterisera mängden och fördelningen av RGC kräver högkvalitativ helmonterad retinal immunfärgning. I allmänhet, i immunfärgningsprotokoll, nedsänks näthinnan i kemiska fixeringsmedel innan den inkuberas i antikroppar. Idealiska fixeringsmedel bör inte ändra cellernas form, tillgängligheten eller affiniteten hos epitoperna för antikroppar eller vävnadens linjära dimensioner 9,10.
På grund av näthinnans komplexa struktur är problem som retinal bräcklighet och vikning, liksom några vanliga svårigheter inklusive cellkrympning och oklara kärnor, benägna att uppstå när man gör en helmonterad retinalplåster, vilket har en negativ inverkan på experimentell forskning. Dessutom är inte alla näthinnor immunfärgade omedelbart, särskilt när det gäller näthinnorna hos transgena möss med dyra priser som är av värdefullt ursprung, vilket kräver bevarande av de extra retinalproverna för vidare användning.
Den lämpliga fixativa lösningen kan fixera vävnaden snabbt, undvika vävnadsautolys, bevara vävnadscellernas normala morfologi och struktur och behålla antigeniciteten hos proteiner och andra ämnen10. För närvarande har formaldehydbaserad fixering använts i stor utsträckning i olika vävnader, inklusive separerade näthinnor, hemisected ögonmusslor och hela ögonbollar10. Vävnadskrympning och morfologisk förändring av celler är de två kritiska utmaningarna som uppstår efter nedsänkning i formaldehyd11. Dessutom framträder modifierade fixeringsformuleringar alltmer för att maximera bibehållandet av näthinnans och målcellernas ursprungliga egenskaper 9,10. Olika retinala fixeringsbehandlingar kan påverka retinalstrukturen, proteinimmunogeniciteten, fluorescensexcitationen och dämpningssläckningscykeln olika12,13. Näthinnor fixerade med Davidsons lösning är mer morfologiskt intakta jämfört med de som fixerats med formalin, men Davidsons lösning är mindre kompatibel med vissa antikroppar, såsom mikroglialmarkörjoniserad kalciumbindningsadaptermolekyl 112. Med tanke på näthinnans bräckliga natur skulle forskare naturligtvis undra om näthinnans integritet, liksom målcellernas egenskaper och morfologi, kommer att förändras efter långvarig lagring. De möjliga effekterna av fixeringslösning på retinal och RGC-cellmorfologi efter lagring i flera månader har dock sällan rapporterats. Optimeringen av retinal fixering är avgörande för utvärdering och bevarande av RGCs.
Vi ger en detaljerad beskrivning av en pålitlig och tekniskt enkel metod som vi använder för helmonterad murin retinal färgning. Vår metod betonar korrekt förberedelse och lagring av näthinnor för RGC-undersökning, med hänsyn till behovet av långvarig lagring av retinal vävnad samt specifika aspekter av fluoroforbildning eller nedbrytning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fixering är ett viktigt steg för att bevara näthinnan, vilket kan påverka eventuella efterföljande RGC-undersökningar baserade på morfologi. Framgångsrik fixering fångar snabbt näthinnans struktur och tillstånd vid tidpunkten för att exponera dem för fixeringsmediet, vilket är avgörande för vidare analys. Även om formaldehyd har ansetts vara ett av de vanligaste fixeringsmedlen för fixering och konservering av vävnader och celler, fungerar formaldehyd ensam inte alltid bra som det optimala kemiska fixe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Hubei Key Laboratories Opening Project (bidrag nr 2021KFY055), Natural Science Foundation of Hubei Province (bidrag nr 2020CFB240) och Fundamental Research Funds for the Central Universities (grant no. 2042020kf0065).
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson’s solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin’s fluid or Davidson’s fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
