I denne undersøgelse beskriver vi metoder til decellularisering, fysisk karakterisering, billeddannelse og in vivo-implantation af plantebaserede biomaterialer samt metoder til cellesåning og differentiering i stilladserne. De beskrevne metoder tillader evaluering af plantebaserede biomaterialer til knoglevævstekniske applikationer.
Planteafledte cellulosebiomaterialer er blevet anvendt i forskellige vævstekniske applikationer. In vivo-undersøgelser har vist den bemærkelsesværdige biokompatibilitet af stilladser fremstillet af cellulose afledt af naturlige kilder. Derudover har disse stilladser strukturelle egenskaber, der er relevante for flere væv, og de fremmer invasion og spredning af pattedyrceller. Nyere forskning ved hjælp af decellulariseret æblehypanthiumvæv har vist ligheden mellem dens porestørrelse og trabekulær knogle samt dens evne til effektivt at understøtte osteogen differentiering. Denne undersøgelse undersøgte yderligere potentialet for æbleafledte cellulosestilladser til knoglevævsteknik (BTE) applikationer og evaluerede deres in vitro og in vivo mekaniske egenskaber. MC3T3-E1 preosteoblaster blev podet i æbleafledte cellulosestilladser, der derefter blev vurderet for deres osteogene potentiale og mekaniske egenskaber. Alkalisk fosfatase og alizarinrød S-farvning bekræftede osteogen differentiering i stilladser dyrket i differentieringsmedium. Histologisk undersøgelse viste udbredt celleinvasion og mineralisering på tværs af stilladserne. Scanningelektronmikroskopi (SEM) afslørede mineralaggregater på overfladen af stilladserne, og energidispersiv spektroskopi (EDS) bekræftede tilstedeværelsen af fosfat- og calciumelementer. På trods af en signifikant stigning i Youngs modul efter celledifferentiering forblev det imidlertid lavere end for sundt knoglevæv. In vivo-undersøgelser viste celleinfiltration og aflejring af ekstracellulær matrix i de decellulariserede æbleafledte stilladser efter 8 ugers implantation i rottecalvaria. Desuden svarede den kraft, der kræves for at fjerne stilladserne fra knogledefekten, til den tidligere rapporterede brudbelastning af naturlig calvarial knogle. Samlet set bekræfter denne undersøgelse, at æbleafledt cellulose er en lovende kandidat til BTE-applikationer. Imidlertid kan forskellen mellem dets mekaniske egenskaber og sunde knoglevævs egenskaber begrænse dets anvendelse til scenarier med lav belastning. Yderligere strukturel rekonstruktion og optimering kan være nødvendig for at forbedre de mekaniske egenskaber af æbleafledte cellulosestilladser til bærende applikationer.
Store knogledefekter forårsaget af en skade eller sygdom kræver ofte biomaterialetransplantater til fuldstændig regenerering1. Nuværende teknikker designet til at forbedre knoglevævsregenerering bruger regelmæssigt autologe, allogene, xenogene eller syntetiske transplantater2. Til autolog knogletransplantation, der betragtes som “guldstandard” podningspraksis for at reparere store knogledefekter, ekstraheres knogle fra patienten. Denne podningsprocedure har imidlertid flere ulemper, herunder størrelses- og formbegrænsninger, vævstilgængelighed og prøvetagningsstedsmorbiditet3. Desuden er autologe podningsprocedurer modtagelige for infektioner på operationsstedet, efterfølgende brud, hæmatomdannelse på prøveudtagningsstedet eller rekonstrueret sted og postoperativ smerte4. Knoglevævsteknik (BTE) tilbyder et potentielt alternativ til konventionelle knogletransplantationsmetoder5. Det kombinerer strukturelle biomaterialer og celler til at opbygge nyt funktionelt knoglevæv. Når man designer biomaterialer til BTE, er det afgørende at kombinere en makroporøs struktur, overfladekemi, der fremmer cellebinding, og mekaniske egenskaber, der ligner dem af native bone6. Tidligere forskning har vist, at den ideelle porestørrelse og elastiske modul for biomaterialer, der anvendes i BTE, er henholdsvis ca. 100-200 μm7 og 0,1-20 GPa afhængigt af podningsstedet8. Desuden er stilladsets porøsitet og poresammenkobling kritiske faktorer, der påvirker cellemigration, næringsstofdiffusion og angiogenese8.
BTE har vist lovende resultater med forskellige biomaterialer udviklet og evalueret som alternative muligheder for knogletransplantater. Nogle af disse biomaterialer er osteoinduktive materialer, hybridmaterialer og avancerede hydrogeler8. Osteoinduktive materialer stimulerer udviklingen af nydannede knoglestrukturer. Hybride materialer består af syntetiske og/eller naturlige polymerer8. Avancerede hydrogeler efterligner den ekstracellulære matrix (ECM) og er i stand til at levere de nødvendige bioaktive faktorer for at fremme knoglevævsintegration8. Hydroxyapatit er et traditionelt materiale og et almindeligt valg til BTE på grund af dets sammensætning og biokompatibilitet9. Bioaktivt glas er en anden type biomateriale til BTE, som har vist sig at stimulere specifikke celleresponser for at aktivere gener, der er nødvendige for osteogenese10,11. Bionedbrydelige polymerer, herunder poly(glycolsyre) og poly(mælkesyre), er også blevet anvendt i vid udstrækning i BTE-applikationer12. Endelig har naturlige eller naturligt afledte polymerer som chitosan, chitin og bakteriel cellulose også vist opmuntrende resultater for BTE13. Mens både syntetiske og naturlige polymerer viser potentiale for BTE, kræver udviklingen af et funktionelt stillads med den ønskede makrostruktur typisk omfattende protokoller.
Omvendt kan indfødte makroskopiske cellulosestrukturer let udvindes fra forskellige planter, og vores forskergruppe har tidligere demonstreret anvendeligheden af cellulosebaserede stilladser afledt af planter til forskellige vævsrekonstruktioner. Efter en simpel overfladeaktiv behandling udnyttede vi plantematerialets iboende struktur og fremhævede dets potentiale som et alsidigt biomateriale14. Desuden kan disse cellulosebaserede stilladser anvendes til in vitro pattedyrcellekulturapplikationer14, er biokompatible og understøtter spontan subkutan vaskularisering 14,15,16,17. Både vores forskningsgruppe og andre har vist, at disse stilladser kan fås fra specifikke anlæg baseret på den tilsigtede anvendelse 14,15,16,17,18,19,20. For eksempel udviser den vaskulære struktur, der observeres i plantestængler og blade, en slående lighed med strukturen, der findes i dyrevæv19. Derudover kan cellulosestilladser afledt af planter let formes og udsættes for overfladebiokemiske ændringer for at opnå de ønskede egenskaber16. I en nylig undersøgelse inkorporerede vi en saltbuffer under decellulariseringsprocessen, hvilket førte til forbedret cellebinding observeret både in vitro og in vivo indstillinger16. I samme undersøgelse demonstrerede vi anvendeligheden af planteafledte cellulosestilladser i kompositbiomaterialer ved at støbe hydrogeler på overfladen af stilladserne. I nyere undersøgelser har funktionalisering af planteafledte stilladser vist sig at forbedre deres effektivitet18. For eksempel afslørede en undersøgelse foretaget af Fontana et al. (2017), at vedhæftningen af humane dermale fibroblaster blev understøttet af RGD-belagte decellulariserede stængler, mens ikke-coatede stængler ikke udviste samme evne18. Desuden demonstrerede forfatterne også, at modificeret simuleret kropsvæske kunne udnyttes til kunstigt at mineralisere decellulariserede plantestængler. I nyere undersøgelser undersøgte vi begrebet mekanosensitiv osteogenese i planteafledte cellulosestilladser og vurderede deres potentiale for BTE17,20. Desuden brugte Lee et al. (2019) planteafledte stilladser til at dyrke knoglelignende væv i en in vitro-indstilling 21. Gennem omfattende evalueringer af forskellige plantekilder identificerede forfatterne æbleafledte stilladser som de mest optimale til dyrkning og differentiering af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er). Desuden foreslog forfatterne, at de strukturelle og mekaniske egenskaber ved de æbleafledte stilladser spiller en afgørende rolle for deres egnethed til det tilsigtede formål. Som de første planteafledte stilladser, der blev implementeret i vævstekniske applikationer, har æbleafledte stilladser i vid udstrækning vist sig at have en slående lignende arkitektur som den menneskelige knogle, især med hensyn til deres indbyrdes forbundne porer, der spænder fra 100 til 200 μm i diameter14,21.
I denne undersøgelse undersøgte vi yderligere potentialet i æbleafledte cellulosestilladser til BTE og gennemførte en analyse af deres mekaniske egenskaber både in vitro og in vivo. Selv om der har været undersøgelser af potentialet i æbleafledte stilladser til BTE 17,20,21, er deres mekaniske egenskaber blevet underundersøgt. Resultaterne viste vild spredning invasion og osteogen differentiering af MC3T3-E1 preosteoblaster podet i stilladser, der blev dyrket i differentieringsmedium i 4 uger. Youngs modul for disse stilladser var 192,0 ± 16,6 kPa, hvilket var signifikant højere end de blanke stilladser (stilladser uden frøede celler) (31,6 ± 4,8 kPa) og de cellefrøede stilladser dyrket i ikke-differentieringsmedium (24,1 ± 8,8 kPa). Det skal dog bemærkes, at Youngs modul for sundt humant knoglevæv typisk ligger inden for intervallet 0,1-2 GPa for trabekulær knogle og ca. 15-20 GPa for kortikal knogle8. Ikke desto mindre, efter en 8-ugers implantation i en gnaverkalvarialdefekt, syntes de cellefrøede stilladser at være godt integreret i den omgivende knogle, som demonstreret af en gennemsnitlig topkraft på 113,6 N ± 18,2 N i push-out-tests, hvilket svarer til den tidligere rapporterede brudbelastning af native calvarial knogle22. Samlet set viser resultaterne fra denne undersøgelse betydelige løfter, især for ikke-bærende applikationer. Imidlertid har æbleafledte cellulosestilladser i øjeblikket ikke de nødvendige mekaniske egenskaber til nøjagtigt at matche det omgivende knoglevæv på et implantatsted. Derfor er der behov for yderligere udvikling for at frigøre det fulde potentiale af disse stilladser.
Flere in vitro– og in vivo-undersøgelser har vist biokompatibiliteten af planteafledt cellulose og dens potentielle anvendelse i vævsteknik 14,15,16,18,19,20, mere specifikt til hosting af osteogen differentiering 20,21. Formålet med denne unders?…
The authors have nothing to disclose.
Finansiering til dette projekt blev ydet af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Discovery Grant) og af Li Ka Shing Foundation. M.L.L. modtog støtte fra Ontario Centers of Excellence TalentEdge-programmet, og RIH blev støttet af et NSERC postgraduate stipendium og et Ontario Graduate Scholarship (OGS).
4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium | Sigma-Aldrich | B5655 | BCIP/NBT |
Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
Dental drill | Surgical tool | ||
Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | ||
Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |