In Vitro ve In Vivo Kemik Doku Mühendisliği için Hücrelerden Arındırılmış Elma Türevi İskeleler
Summary
Bu çalışmada, bitki bazlı biyomalzemelerin hücre çözme, fiziksel karakterizasyon, görüntüleme ve in vivo implantasyon yöntemlerinin yanı sıra yapı iskelelerinde hücre tohumlama ve farklılaşma yöntemlerini detaylandırıyoruz. Açıklanan yöntemler, kemik dokusu mühendisliği uygulamaları için bitki bazlı biyomalzemelerin değerlendirilmesine izin verir.
Abstract
Bitki kaynaklı selüloz biyomalzemeleri çeşitli doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmıştır. İn vivo çalışmalar, doğal kaynaklardan elde edilen selülozdan yapılmış iskelelerin dikkate değer biyouyumluluğunu göstermiştir. Ek olarak, bu iskeleler, birden fazla doku için geçerli olan yapısal özelliklere sahiptir ve memeli hücrelerinin istilasını ve çoğalmasını teşvik eder. Hücreden arındırılmış elma hipantyum dokusu kullanılarak yapılan son araştırmalar, gözenek boyutunun trabeküler kemiğe benzerliğini ve osteojenik farklılaşmayı etkili bir şekilde destekleme yeteneğini göstermiştir. Bu çalışmada ayrıca kemik dokusu mühendisliği (BTE) uygulamaları için elma türevli selüloz iskelelerin potansiyeli incelenmiş ve bunların in vitro ve in vivo mekanik özellikleri değerlendirilmiştir. MC3T3-E1 preosteoblastları, daha sonra osteojenik potansiyelleri ve mekanik özellikleri açısından değerlendirilen elma türevli selüloz iskelelere ekildi. Alkalen fosfataz ve alizarin kırmızısı S boyaması, diferansiyasyon ortamında kültürlenen iskelelerde osteojenik farklılaşmayı doğruladı. Histolojik inceleme, iskeleler boyunca yaygın hücre invazyonu ve mineralizasyonu gösterdi. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), iskelelerin yüzeyinde mineral agregaları ortaya çıkardı ve enerji dağıtıcı spektroskopi (EDS), fosfat ve kalsiyum elementlerinin varlığını doğruladı. Bununla birlikte, hücre farklılaşmasını takiben Young modülünde önemli bir artışa rağmen, sağlıklı kemik dokusundan daha düşük kalmıştır. İn vivo çalışmalar, sıçan kalvarisinde 8 haftalık implantasyondan sonra hücre infiltrasyonu ve hücre dışı matriksin hücre dışı matriks birikimi gösterdi. Ek olarak, iskeleleri kemik defektinden çıkarmak için gereken kuvvet, daha önce bildirilen doğal kalvarial kemiğin kırık yüküne benzerdi. Genel olarak, bu çalışma, elma türevi selülozun BTE uygulamaları için umut verici bir aday olduğunu doğrulamaktadır. Bununla birlikte, mekanik özellikleri ile sağlıklı kemik dokusununkiler arasındaki farklılık, uygulanmasını düşük yük taşıma senaryolarıyla sınırlayabilir. Yük taşıma uygulamaları için elmadan elde edilen selüloz iskelelerin mekanik özelliklerini geliştirmek için ek yapısal yeniden mühendislik ve optimizasyon gerekebilir.
Introduction
Bir yaralanma veya hastalığın neden olduğu büyük kemik kusurları, tam rejenerasyon için genellikle biyomateryal greftleri gerektirir1. Kemik dokusu rejenerasyonunu iyileştirmek için tasarlanmış mevcut teknikler düzenli olarak otolog, allojeneik, ksenojenik veya sentetik greftler kullanır2. Büyük kemik kusurlarını onarmak için “altın standart” greftleme uygulaması olarak kabul edilen otolog kemik grefti için hastadan kemik çıkarılır. Bununla birlikte, bu aşılama prosedürünün boyut ve şekil sınırlamaları, doku mevcudiyeti ve örnekleme bölgesi morbiditesi dahil olmak üzere çeşitli dezavantajları vardır3. Ayrıca, otolog greftleme prosedürleri cerrahi alan enfeksiyonlarına, müteakip kırıklara, örnekleme veya yeniden yapılandırma bölgesinde hematom oluşumuna ve ameliyat sonrası ağrıya duyarlıdır4. Kemik dokusu mühendisliği (BTE), geleneksel kemik grefti yöntemlerine potansiyel bir alternatif sunar5. Yeni fonksiyonel kemik dokusu oluşturmak için yapısal biyomalzemeleri ve hücreleri birleştirir. BTE için biyomalzemeler tasarlarken, makro gözenekli bir yapıyı, hücre bağlanmasını destekleyen yüzey kimyasını ve doğal kemiğe çok benzeyen mekanik özellikleri birleştirmek çok önemlidir6. Geçmiş araştırmalar, BTE’de kullanılan biyomalzemeler için ideal gözenek boyutunun ve elastik modülün, aşılama bölgesine bağlı olarak sırasıyla yaklaşık 100-200μm7 ve 0.1-20 GPa olduğunu göstermiştir8. Ayrıca, yapı iskelelerinin gözenekliliği ve gözeneklerin birbirine bağlanması, hücre göçünü, besin difüzyonunu ve anjiyogenezi etkileyen kritik faktörlerdir8.
BTE, kemik greftlerine alternatif seçenekler olarak geliştirilen ve değerlendirilen çeşitli biyomateryaller ile umut verici sonuçlar göstermiştir. Bu biyomalzemelerden bazıları osteoindüktif malzemeler, hibrit malzemeler ve gelişmiş hidrojellerdir8. Osteoindüktif materyaller yeni oluşan kemik yapılarının gelişimini uyarır. Hibrit malzemeler sentetik ve/veya doğal polimerlerden oluşur8. Gelişmiş hidrojeller, hücre dışı matrisi (ECM) taklit eder ve kemik dokusu entegrasyonunu desteklemek için gerekli biyoaktif faktörleri sağlayabilir8. Hidroksiapatit geleneksel bir malzemedir ve bileşimi ve biyouyumluluğu nedeniyle BTE için yaygın bir seçimdir9. Biyoaktif cam, osteogenez10,11 için gerekli genleri aktive etmek için spesifik hücre tepkilerini uyardığı gösterilen BTE için başka bir biyomateryal türüdür. Poli (glikolik asit) ve poli (laktik asit) dahil olmak üzere biyolojik olarak parçalanabilen polimerler de BTE uygulamalarında yaygın olarak kullanılmaktadır12. Son olarak, kitosan, kitin ve bakteriyel selüloz gibi doğal veya doğal olarak türetilmiş polimerler de BTE13 için cesaret verici sonuçlar göstermiştir. Bununla birlikte, hem sentetik hem de doğal polimerler BTE için potansiyel gösterirken, istenen makro yapıya sahip fonksiyonel bir iskelenin geliştirilmesi tipik olarak kapsamlı protokoller gerektirir.
Tersine, doğal makroskopik selüloz yapıları, çeşitli bitkilerden kolayca elde edilebilir ve araştırma grubumuz daha önce bitkilerden türetilen selüloz bazlı iskelelerin farklı doku rekonstrüksiyonlarına uygulanabilirliğini göstermiştir. Gerçekten de, basit bir yüzey aktif madde işleminin ardından, bitki materyalinin doğal yapısından yararlandık ve çok yönlü bir biyomateryal olarak potansiyelini vurguladık14. Ayrıca, bu selüloz bazlı iskeleler, in vitro memeli hücre kültürü uygulamaları14 için kullanılabilir, biyouyumludur ve spontan deri altı vaskülarizasyonudestekler 14,15,16,17. Hem araştırma grubumuz hem de diğerleri, bu iskelelerin amaçlanan uygulamaya göre belirli bitkilerden elde edilebileceğinigöstermiştir 14,15,16,17,18,19,20. Örneğin, bitki sap ve yapraklarında gözlenen damar yapısı, hayvan dokularında bulunan yapı ile çarpıcı bir benzerlik göstermektedir19. Ek olarak, bitkilerden elde edilen selüloz iskeleler, istenen özellikleri elde etmek için kolayca şekillendirilebilir ve yüzey biyokimyasal modifikasyonlarına tabi tutulabilir16. Yakın tarihli bir çalışmada, hücreden arındırma işlemi sırasında bir tuz tamponu ekledik ve bu da hem in vitro hem de in vivo ortamlarda gözlemlenen gelişmiş hücre bağlanmasına yol açtı16. Aynı çalışmada, bitki kaynaklı selüloz iskelelerin, iskelelerin yüzeyine hidrojeller dökülerek kompozit biyomalzemelerde uygulanabilirliğini gösterdik. Son çalışmalarda, bitki kaynaklı iskelelerin işlevselleştirilmesinin etkinliklerini arttırdığı gösterilmiştir18. Örneğin, Fontana ve ark. (2017), insan dermal fibroblastlarının yapışmasının RGD kaplı hücrelerden arındırılmış gövdeler tarafından desteklendiğini, oysa kaplanmamış gövdelerin aynı yeteneği sergilemediğini ortaya koymuştur18. Ayrıca, yazarlar ayrıca, modifiye edilmiş simüle edilmiş vücut sıvısının, hücrelerden arındırılmış bitki gövdelerini yapay olarak mineralize etmek için kullanılabileceğini gösterdiler. Daha yakın tarihli çalışmalarda, bitki kaynaklı selüloz iskelelerde mekanosensitif osteogenez kavramını araştırdık ve BTE17,20 için potansiyellerini değerlendirdik. Ayrıca, Lee ve ark. (2019), in vitro ortamda kemik benzeri dokuları yetiştirmek için bitki kaynaklı iskeleler kullandı21. Yazarlar, farklı bitki kaynaklarının kapsamlı değerlendirmeleri yoluyla, elma kaynaklı yapı iskelelerini, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC’ler) kültürü ve farklılaşması için en uygun yapı iskelesi olarak tanımladılar. Ayrıca yazarlar, elmadan elde edilen iskelelerin yapısal ve mekanik özelliklerinin, amaçlanan amaca uygunluklarında çok önemli bir rol oynadığını öne sürdüler. Doku mühendisliği uygulamalarında uygulanan ilk bitki kaynaklı iskeleler olan elma türevi iskelelerin, özellikle çapı 100 ila 200 μm arasında değişen birbirine bağlı gözenekleri açısından insan kemiğine çarpıcı bir şekilde benzer bir mimariye sahip olduğu kapsamlı bir şekilde gösterilmiştir14,21.
Bu çalışmada, BTE için elma türevi selüloz iskelelerin potansiyelini daha fazla araştırdık ve hem in vitro hem de in vivo mekanik özelliklerinin bir analizini gerçekleştirdik. BTE 17,20,21 için elma türevi iskelelerin potansiyeli üzerine çalışmalar yapılmış olmasına rağmen, mekanik özellikleri yeterince araştırılmamıştır. Sonuçlar, 4 hafta boyunca farklılaşma ortamında kültürlenen iskelelerde tohumlanan MC3T3-E1 preosteoblastlarının vahşi yayılım invazyonunu ve osteojenik farklılaşmasını gösterdi. Bu iskelelerin Young modülü 192.0 ± 16.6 kPa idi, bu da boş iskelelerden (tohumlu hücreler olmadan iskeleler) (31.6 ± 4.8 kPa) ve farklılaşma olmayan ortamda kültürlenen hücre tohumlu iskelelerden (24.1 ± 8.8 kPa) önemli ölçüde daha yüksekti. Bununla birlikte, Young’ın sağlıklı insan kemik dokusu modülünün tipik olarak trabeküler kemik için 0.1-2 GPa ve kortikal kemik8 için yaklaşık 15-20 GPa aralığında olduğuna dikkat edilmelidir. Bununla birlikte, bir kemirgen kalvarial defektinde 8 haftalık bir implantasyonun ardından, hücre tohumlu iskelelerin, itme testlerinde ortalama 113.6 N ± 18.2 N’lik bir tepe kuvveti ile gösterildiği gibi, çevredeki kemiğe iyi bir şekilde entegre olduğu görülmüştür, bu da daha önce bildirilen doğal kalvarial kemik22’nin kırık yüküne benzer. Genel olarak, bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, özellikle yük taşımayan uygulamalar için önemli bir umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, elmadan elde edilen selüloz iskeleler, şu anda bir implant bölgesinde çevreleyen kemik dokusunu tam olarak eşleştirmek için gerekli mekanik özelliklere sahip değildir. Sonuç olarak, bu iskelelerin tüm potansiyelini ortaya çıkarmak için daha fazla geliştirme yapılması gerekmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birkaç in vitro ve in vivo çalışma, bitki kaynaklı selülozun biyouyumluluğunu ve doku mühendisliğindepotansiyel kullanımını göstermiştir 14,15,16,18,19,20, daha spesifik olarak osteojenik farklılaşmaya ev sahipliği yapmak için 20,21…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu projenin finansmanı Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) (Discovery Grant) ve Li Ka Shing Vakfı tarafından sağlanmıştır. MLL, Ontario Mükemmeliyet Merkezleri TalentEdge programından destek aldı ve RJH, NSERC lisansüstü bursu ve Ontario Yüksek Lisans Bursu (OGS) ile desteklendi.
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium | Sigma-Aldrich | B5655 | BCIP/NBT |
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| Dental drill | Surgical tool | ||
| Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
| Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
| High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
| McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
| Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
| Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
| Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
| Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
References
- Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
- Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
- Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
- Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
- Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
- Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
- Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
- Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
- Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
- Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835 (2014).
- Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
- Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
- Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415 (2023).
- Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225 (2017).
- Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
- Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030 (2022).
- Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194 (2019).
- Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P. . Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy – Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
- . . tousimis Critical Point Dryers – Samdri®-PVT-3D. , (2022).
- . . Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , (2023).
- Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
- Leblanc Latour, M. . Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , (2023).
- Kodama, H. -. A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
- Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
- Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
- Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
- Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541 (2021).
