Essai de viabilité des conidies de Trichoderma stromaticum à l’intérieur des macrophages dérivés de mononucléaires du sang périphérique humain

Summary

La technique impliquant la phagocytose des conidies fongiques par les macrophages est largement utilisée pour les études évaluant la modulation des réponses immunitaires contre les champignons. L’objectif de ce manuscrit est de présenter une méthode d’évaluation de la phagocytose et des capacités de clairance des macrophages dérivés de mononucléaires du sang périphérique humain stimulés par des conidies de Trichoderma stromaticum .

Abstract

Les macrophages représentent une ligne de défense cruciale et sont responsables de la prévention de la croissance et de la colonisation des agents pathogènes dans différents tissus. La phagocytose conidiale est un processus clé qui permet d’étudier les événements cytoplasmiques et moléculaires impliqués dans les interactions macrophages-pathogènes, ainsi que de déterminer le moment de la mort des conidies internalisées. La technique impliquant la phagocytose des conidies fongiques par les macrophages est largement utilisée pour les études évaluant la modulation des réponses immunitaires contre les champignons. L’évasion de la phagocytose et la fuite des phagosomes sont des mécanismes de virulence fongique. Nous rapportons ici les méthodes qui peuvent être utilisées pour l’analyse de la phagocytose, de la clairance et de la viabilité des conidies de T. stromaticum , un champignon qui est utilisé comme agent de lutte biologique et de biofertilisant et qui est capable d’induire des infections humaines. Le protocole consiste en 1) la culture de Trichoderma , 2) le lavage pour obtenir des conidies, 3) l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par la méthode de la solution de polysaccharose et la différenciation des PBMC en macrophages, 4) une méthode de phagocytose in vitro utilisant des lamelles de verre rondes et une coloration, et 5) un test de clairance pour évaluer la viabilité des conidies après phagocytose des conidies. En résumé, ces techniques peuvent être utilisées pour mesurer l’efficacité de la clairance fongique des macrophages.

Introduction

Le genre Trichoderma (Ordre : Hypocreales, Famille : Hypocreaceae) est composé de champignons saprophytes omniprésents qui sont des parasites d’autres espèces fongiques et sont capables de produire une gamme d’enzymes commercialement utiles¹. Ces espèces fongiques sont utilisées pour la production de protéines hétérologues², la production de cellulose³, d’éthanol, de bière, de vin et de papier⁴, dans l’industrie textile⁵, l’industrie alimentaire⁶ et dans l’agriculture comme agents de lutte biologique ^7,8. Outre l’intérêt industriel pour ces espèces fongiques, le nombre croissant d’infections chez l’homme a donné à certaines espèces de Trichoderma le statut d’agents pathogènes opportunistes⁹.

Trichoderma spp. se développe rapidement en culture, avec des colonies initialement blanches et cotonneuses qui virent au jaune verdâtre au vert foncé¹⁰. Ils sont adaptés pour vivre dans une large gamme de conditions de pH et de température, et les espèces opportunistes sont capables de survivre à des pH et des températures physiologiques et, ainsi, de coloniser différents tissus humains 11,12,13. Il est important de noter que l’augmentation du taux d’infection de Trichoderma spp. peut être associée à des facteurs de virulence, qui ne sont pas bien étudiés. De plus, les études axées sur la compréhension de la réponse immunitaire contre les espèces opportunistes de Trichoderma sont encore rares.

Lors d’une infection, avec les neutrophiles, les macrophages représentent la ligne de défense responsable de la phagocytose et, ainsi, empêchent la croissance et la colonisation des agents pathogènes dans différents tissus. À l’aide de récepteurs de reconnaissance de formes, tels que les récepteurs de type Toll et les récepteurs de lectine de type C, les macrophages phagocytent les champignons et les transforment en phagolysosomes, favorisant ainsi une explosion respiratoire, la libération de cytokines pro-inflammatoires et la destruction des micro-organismes phagocytés¹⁴. Le mécanisme de la phagocytose, cependant, peut être affecté et évité par différentes stratégies microbiennes, telles que la taille et la forme des cellules fongiques ; la présence de capsules qui entravent la phagocytose ; diminution du nombre de récepteurs induisant la phagocytose ; le remodelage de la structure des fibres d’actine dans le cytoplasme ; entravant la formation de pseudopodes ; et le phagosome ou le phagolysosome s’échappent après le processus de phagocytose¹⁴.

De nombreux agents pathogènes, y compris Cryptococcus neoformans, utilisent les macrophages comme niche pour survivre dans l’hôte, disséminer et induire l’infection¹⁵. Le test de phagocytose et de clairance est utilisé pour évaluer la réponse immunitaire contre les agents pathogènes et pour identifier les stratégies microbiennes employées pour échapper au système immunitaire inné 15,16,17. Ce type de technique peut également être utilisé pour examiner la cinétique différentielle de la phagocytose, de l’acidification retardée des phagosomes et de l’éclatement oxydatif qui entraînent une réduction de la destruction fongique¹⁸.

Différentes méthodes peuvent être utilisées pour évaluer la phagocytose, la survie fongique et l’évasion du processus de maturation des phagosomes. Il s’agit notamment de la microscopie à fluorescence, qui est utilisée pour observer la phagocytose, la localisation cellulaire et les molécules produites lors de la phagocytose¹⁹ ; la cytométrie en flux, qui fournit des données quantitatives sur la phagocytose et permet d’évaluer les différents marqueurs impliqués dans le processus^20,21 ; microscopie intravitale, qui est utilisée pour évaluer la capture microbienne et la maturation des phagosomes²² ; phagocytose médiée par les anticorps, qui est utilisée pour évaluer la spécificité du processus de phagocytose d’un agent pathogène²³ ; et autres 24,25,26,27.

Le protocole présenté ici utilise une méthode courante, peu coûteuse et directe utilisant un microscope optique et un test de croissance sur plaque pour évaluer la phagocytose et la destruction des conidies fongiques. Ce protocole fournira aux lecteurs des instructions étape par étape pour effectuer le test de phagocytose et de clairance à l’aide de macrophages humains dérivés de mononucléaires du sang périphérique exposés à T. stromaticum. Les PBMC ont été utilisés parce que les conidies de Trichoderma sont appliquées comme biocontrôle contre les phytopathogènes et comme biofertilisant pour les cultures végétales dans le monde entier et ont causé plusieurs infections humaines, appelées tricholodermose. En outre, il n’existe que deux travaux antérieurs portant sur l’interaction entre les conidies Trichoderma et le système immunitaire humain, dans lesquels nous avons examiné les neutrophiles²⁸ et l’autophagie dans les macrophages²⁹. Cet article montre d’abord comment la phagocytose des conidies de T. stromaticum par des macrophages dérivés de PBMC peut être étudiée, puis comment la viabilité des conidies englouties peut être évaluée à l’aide de techniques simples basées sur la microscopie. Ce protocole pourrait faciliter davantage les recherches sur la réponse immunitaire associée aux macrophages ou les mécanismes liés à la modulation du système immunitaire.

Protocol

Considérations éthiques et sujets humainsToutes les expériences sur des humains décrites dans cette étude ont été menées conformément à la Déclaration d’Helsinki et aux lois fédérales brésiliennes et approuvées par le Comité d’éthique de l’Université d’État de Santa Cruz (code d’identification du projet : 550.382/2014). Du sang périphérique humain a été prélevé sur des volontaires sains de la ville d’Ilhéus, Bahia, Brésil, non exposé…

Representative Results

La technique impliquant la phagocytose des conidies fongiques par les macrophages est largement utilisée pour les études évaluant la modulation des réponses immunitaires contre les champignons. Nous avons utilisé la phagocytose des conidies de T. stromaticum pour évaluer la viabilité des conidies après phagocytose, puisque l’évasion de la phagocytose et la fuite des phagosomes sont des mécanismes de virulence fongique. Les chercheurs devraient effectuer ces techniques comme l’un des premiers essais…

Discussion

Pour plusieurs agents pathogènes fongiques, y compris Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans et d’autres, la phagocytose conidiale ou de levure est un processus clé qui permet d’étudier les événements cytoplasmiques et moléculaires dans les interactions macrophage-pathogène, ainsi que de déterminer l’heure de la mort des conidies internalisées^14,39,40. La phagocytose est l…

Materials

15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan	Merck	1.07961	Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon			database of images
Glycerol	Merck	24900988	The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077			polysucrose solution
Image J			Image analysis software
Microscopy slides	Precision	7105	Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge	Prism	C1801	The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.