ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内の トリコデルマ・ストロマティカム 分生子の生存率アッセイ

Summary

マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。この原稿の目的は、 Trichoderma stromaticum conidiaで刺激されたヒト末梢血単核由来マクロファージの食作用とクリアランス能力を評価する方法を提示することです。

Abstract

マクロファージは重要な防衛線であり、さまざまな組織における病原体の増殖とコロニー形成を防ぐ役割を担っています。分生子食作用は、マクロファージと病原体の相互作用に関与する細胞質および分子イベントの調査、および内在化された分生子の死亡時期の決定を可能にする重要なプロセスです。マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。食作用の回避とファゴソームの脱出は、真菌の病原性のメカニズムです。本稿では、生物防除・バイオ肥料剤として利用され、ヒトへの感染を誘発する真菌である T. stromaticum conidiaの食作用、クリアランス、生存率の解析に用いる手法について報告する。プロトコルは、1) トリコデルマ 培養、2)分生子を得るための洗浄、3)ポリスクロース溶液法を使用した末梢血単核細胞(PBMC)の隔離とマクロファージへのPBMCの微分、4)丸いガラスカバースリップと着色を使用した 生体外 食作用法、および5)分生子食作用後の分生子の生存率を評価するためのクリアランスアッセイで構成されています。要約すると、これらの技術は、マクロファージの真菌クリアランス効率を測定するために使用できます。

Introduction

トリコデルマ属(目:Hypocreales、科:Hypocreaceae)は、他の真菌種の寄生虫であり、商業的に有用な酵素の範囲を生産することができる遍在する腐生菌で構成されています¹。これらの真菌種は、異種タンパク質の生産^2、セルロース³、エタノール、ビール、ワイン、紙の生産⁴、繊維産業⁵、食品産業⁶、農業の生物的防除剤^7,8として使用されています。これらの真菌種に対する産業上の関心に加えて、ヒトにおける感染数の増加により、一部のトリコデルマ種は日和見病原体の地位を得ています⁹。

Trichoderma spp.は培養で急速に成長し、最初は白と綿のコロニーが緑がかった黄色から濃い緑色に変わります¹⁰。それらは広範囲のpHおよび温度条件で生息するように適応しており、日和見種は生理学的pHおよび温度で生き残ることができるため、さまざまなヒト組織にコロニーを形成します11,12,13。重要なことは、トリコデルマ属菌の感染率の上昇は病原性因子と関連している可能性があり、これらは十分に研究されていないことです。さらに、日和見トリコデルマ種に対する免疫応答の理解に焦点を当てた研究はまだまれです。

感染中、好中球とともに、マクロファージは食作用の原因となる防御線を表し、したがって、異なる組織における病原体の増殖およびコロニー形成を防止する。Toll様受容体やC型レクチン受容体などのパターン認識受容体を用いて、マクロファージは貪食菌をファゴリソソームに加工し、呼吸バースト、炎症誘発性サイトカインの放出、および食作用微生物の破壊を促進する¹⁴。しかし、食作用のメカニズムは、真菌細胞のサイズや形状など、さまざまな微生物戦略の影響を受け、回避される可能性があります。食作用を妨げるカプセルの存在。食作用誘導受容体の数を減少させる。細胞質におけるアクチン線維の構造のリモデリング。仮足の形成を妨げる。ファゴソームまたはファゴリソソームは、食作用プロセス後に脱出する¹⁴。

クリプトコッカス・ネオフォルマンスを含む多くの病原体は、マクロファージをニッチとして利用し、宿主内で生存し、播種し、感染を誘発する¹⁵。食作用およびクリアランスアッセイは、病原体に対する免疫応答を評価し、自然免疫系を回避するために採用された微生物戦略を特定するために使用されます15,16,17。この種の手法は、真菌の殺傷を減少させる食作用、ファゴソームの酸性化の遅延、および酸化的バーストの動態の違いを調べるためにも使用できます¹⁸。

貪食、真菌の生存、およびファゴソーム成熟過程の回避を評価するために、さまざまな方法を使用することができる。これらには、貪食、細胞位置、および食作用中に生成される分子を観察するために使用される蛍光顕微鏡法が含まれます¹⁹。フローサイトメトリーは、食作用に関する定量的データを提供し、プロセスに関与するさまざまなマーカーを評価するために使用されます^20,21。生体内顕微鏡検査は、微生物の捕捉とファゴソームの成熟を評価するために使用されます²²。病原体の食作用過程の特異性を評価するために使用される抗体媒介性食作用²³;その他24,25,26,27。

ここに示されるプロトコルは真菌の分生子の食作用そして殺害を評価するのに光学顕微鏡および版の成長の試金を使用して共通の、安価、および直接方法を採用する。このプロトコルは、T. stromaticumに曝露されたヒト末梢血単核由来マクロファージを使用して食作用およびクリアランスアッセイを行うためのステップバイステップの指示を読者に提供します。PBMCが使用されたのは、トリコデルマ分生子が植物病原体に対する生物防除および植物作物のバイオ肥料として世界中で適用されており、トリコデルモ症と呼ばれるいくつかのヒト感染症を引き起こしているためです。それ以外に、トリコデルマ分生子とヒトの免疫系との相互作用に焦点を当てた先行研究は2つしかなく、マクロファージの好中球²⁸とオートファジー29を調べました。本稿では、まずPBMC由来のマクロファージによるT. stromaticumの分生子の貪食を研究し、次に、巻き込まれた分生子の生存率を簡単な顕微鏡ベースの技術を用いて評価する方法を示します。このプロトコルは、マクロファージ関連の免疫応答または免疫系の調節関連メカニズムの研究をさらに促進する可能性があります。

Protocol

倫理的配慮と人間的対象この研究で説明されている人間を用いたすべての実験は、ヘルシンキ宣言およびブラジル連邦法に従って実施され、サンタクルス州立大学の倫理委員会(プロジェクト識別コード:550.382 / 2014)によって承認されました。 ヒト末梢血は、ブラジルのバイーア州イリェウス市の健康なボランティアから収集され、研究された真菌に関連す…

Representative Results

マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。貪食の回避とファゴソームの脱出は真菌の病原性のメカニズムであるため、 T. stromaticum 分生子の食作用を用いて、食作用後の分生子の生存率を評価した。研究者は、臨床的に関心のある種を調査する際に、最初のアッセイの1つとしてこれらの手法を実行?…

Discussion

Aspergillus fumigatus、Cryptococcus、Candida albicansなどのいくつかの真菌病原体にとって、分生子または酵母の食作用は、マクロファージと病原体の相互作用における細胞質および分子イベントの調査、および内在化された分生子の死亡時期の決定を可能にする重要なプロセスです14,39,40。食作用は、トリコ?…

Materials

15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan	Merck	1.07961	Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon			database of images
Glycerol	Merck	24900988	The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077			polysucrose solution
Image J			Image analysis software
Microscopy slides	Precision	7105	Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge	Prism	C1801	The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.