Анализ жизнеспособности конидий Trichoderma stromaticum в мононуклеарных макрофагах периферической крови человека

Summary

Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Целью данной статьи является представление метода оценки фагоцитоза и клиренсных способностей мононуклеарных макрофагов периферической крови человека, стимулированных конидиями Trichoderma stromaticum .

Abstract

Макрофаги представляют собой важнейшую линию защиты и отвечают за предотвращение роста и колонизации патогенов в различных тканях. Конидиальный фагоцитоз является ключевым процессом, позволяющим исследовать цитоплазматические и молекулярные события, участвующие в макрофагально-патогенных взаимодействиях, а также определять время гибели интернализованных конидий. Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Уклонение от фагоцитоза и ускользание фагосом являются механизмами вирулентности грибов. Здесь мы сообщаем о методах, которые могут быть использованы для анализа фагоцитоза, клиренса и жизнеспособности T. stromaticum conidia, гриба, который используется в качестве агента биоконтроля и биоудобрения и способен вызывать инфекции человека. Протокол состоит из: 1) культивирования триходермы , 2) промывки для получения конидий, 3) выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МПКМ) методом раствора полисахарозы и дифференцировки МПМК в макрофаги, 4) метода фагоцитоза in vitro с использованием круглых стеклянных покровных стекол и окраски, и 5) анализа клиренса для оценки жизнеспособности конидий после фагоцитоза конидий. Таким образом, эти методы могут быть использованы для измерения эффективности выведения макрофагов из грибков.

Introduction

Род Trichoderma (Отряд: Hypocreales, Семейство: Hypocreaceae) состоит из вездесущих сапрофитных грибов, которые являются паразитами других видов грибов и способны продуцировать ряд коммерчески полезных ферментов¹. Эти виды грибов используются для производства гетерологичных белков², производства целлюлозы³, этанола, пива, вина и бумаги⁴, в текстильной промышленности⁵, пищевой промышленности⁶ и в сельском хозяйстве в качестве агентов биологического контроля ^7,8. В дополнение к промышленному интересу к этим грибковым видам, растущее число инфекций у людей придало некоторым видам Trichoderma статус условно-патогенных микроорганизмов.

Trichoderma spp. быстро растет в культуре, с первоначально белыми и хлопковыми колониями, которые становятся зеленовато-желтыми или темно-зелеными¹⁰. Они приспособлены к жизни в широком диапазоне рН и температурных условий, а условно-патогенные виды способны выживать при физиологических рН и температурах и, таким образом, колонизировать различные ткани человека 11,12,13. Важно отметить, что рост заболеваемости Trichoderma spp. может быть связан с факторами вирулентности, а они недостаточно изучены. Кроме того, исследования, направленные на понимание иммунного ответа против условно-патогенных видов Trichoderma, все еще редки.

Во время инфекции, наряду с нейтрофилами, макрофаги представляют собой линию защиты, отвечающую за фагоцитоз, и, таким образом, препятствуют росту и колонизации возбудителей в различных тканях. Используя рецепторы распознавания образов, такие как Toll-подобные рецепторы и лектиновые рецепторы C-типа, макрофаги фагоцитозируют грибы и перерабатывают их в фаголизосомы, тем самым способствуя дыхательному взрыву, высвобождению провоспалительных цитокинов и уничтожению фагоцитозированных микроорганизмов¹⁴. Механизм фагоцитоза, однако, может быть затронут и уклонен от различных микробных стратегий, таких как размер и форма грибковых клеток; наличие капсул, препятствующих фагоцитозу; уменьшение количества рецепторов, индуцирующих фагоцитоз; ремоделирование структуры актиновых волокон в цитоплазме; препятствующие образованию псевдоподий; и фагосома или фаголизосома ускользают после процесса фагоцитоза¹⁴.

Многие патогены, в том числе Cryptococcus neoformans, используют макрофаги в качестве ниши для выживания в организме хозяина, распространения и индуцирования инфекции¹⁵. Анализ фагоцитоза и клиренса используется для оценки иммунного ответа против патогенов и определения микробных стратегий, используемых для уклонения от врожденной иммунной системы 15,16,17. Этот тип метода также может быть использован для изучения дифференциальной кинетики фагоцитоза, замедленного закисления фагосом и окислительного взрыва, которые приводят к уменьшению гибели грибков¹⁸.

Различные методы могут быть использованы для оценки фагоцитоза, выживаемости грибов и уклонения от процесса созревания фагосом. К ним относятся флуоресцентная микроскопия, которая используется для наблюдения за фагоцитозом, расположением клеток и молекулами, образующимися во время фагоцитоза¹⁹; проточная цитометрия, которая дает количественные данные о фагоцитозе и используется для оценки различных маркеров, участвующих в процессе^20,21; прижизненная микроскопия, которая используется для оценки микробного захвата и созревания фагосом²²; антитело-опосредованный фагоцитоз, который используется для оценки специфичности процесса фагоцитоза для возбудителя²³; и другие 24,25,26,27.

Протокол, представленный здесь, использует обычный, недорогой и прямой метод с использованием оптического микроскопа и анализа роста пластин для оценки фагоцитоза и гибели грибковых конидий. Этот протокол предоставит читателям пошаговую инструкцию по проведению анализа фагоцитоза и клиренса с использованием мононуклеарных макрофагов периферической крови человека, подвергшихся воздействию T. stromaticum. ПБМК были использованы в связи с тем, что конидии Trichoderma применяются в качестве биоконтроля против фитопатогенов и биоудобрения для растительных культур во всем мире и вызывают несколько инфекций человека, называемых триходермозами. Кроме того, существует только две предыдущие работы, посвященные взаимодействию между конидиями Trichoderma и иммунной системой человека, в которых мы изучали нейтрофилы²⁸ и аутофагию у макрофагов²⁹. В данной статье сначала показано, как можно изучать фагоцитоз конидий T. stromaticum макрофагами, полученными из PBMC, а затем как можно оценить жизнеспособность поглощенных конидий с помощью простых методов, основанных на микроскопии. Этот протокол может способствовать дальнейшему изучению макрофаг-ассоциированного иммунного ответа или механизмов, связанных с модуляцией иммунной системы.

Protocol

Этические соображения и люди-субъектыВсе эксперименты на людях, описанные в этом исследовании, были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и федеральными законами Бразилии и одобрены Комитетом по этике Государственного университета Санта-Крус (идентификацио…

Representative Results

Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Мы использовали фагоцитоз конидий T. stromaticum для оценки жизнеспособности конидий после фагоцитоза, поскольку уклонение от фагоцитоза и в?…

Discussion

Для некоторых грибковых патогенов, включая Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans и другие, конидиальный или дрожжевой фагоцитоз является ключевым процессом, позволяющим исследовать цитоплазматические и молекулярные события во взаимодействиях макрофагов и патогенов, а также оп…

Materials

15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan	Merck	1.07961	Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon			database of images
Glycerol	Merck	24900988	The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077			polysucrose solution
Image J			Image analysis software
Microscopy slides	Precision	7105	Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge	Prism	C1801	The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.