Une procédure pour la cryosection du ganglion de la racine dorsale de la souris

Résumé

Nous présentons ici le développement permettant d’acquérir systématiquement des coupes de cryostat ganglionnaire de racine dorsale de haute qualité.

Résumé

Des coupes de cryostat de ganglion de la racine dorsale (DRG) de souris de haute qualité sont cruciales pour une coloration immunochimique appropriée et des études RNAscopique dans la recherche de douleurs inflammatoires et neuropathiques, de démangeaisons, ainsi que d’autres affections neurologiques périphériques. Cependant, il reste difficile d’obtenir systématiquement des coupes de cryostat de haute qualité, intactes et plates sur des lames de verre en raison de la petite taille de l’échantillon du tissu DRG. Jusqu’à présent, il n’existe pas d’article décrivant un protocole optimal pour la cryosection DRG. Ce protocole présente une méthode étape par étape pour résoudre les difficultés fréquemment rencontrées associées à la cryosection DRG. L’article présenté explique comment retirer le liquide environnant des échantillons de tissus DRG, placer les sections DRG sur la lame orientées dans la même orientation et aplatir les sections sur la lame de verre sans se courber. Bien que ce protocole ait été développé pour la cryosection des échantillons DRG, il peut être appliqué pour la cryosection de nombreux autres tissus avec une petite taille d’échantillon.

Introduction

Le ganglion de la racine dorsale (DRG) contient les neurones sensoriels primaires, les macrophages tissulaires et les cellules satellites qui entourent les neurones sensoriels primaires 1,2,3,4. Il s’agit d’une structure anatomique clé dans le traitement des signaux inoffensifs et nocifs, et joue un rôle essentiel dans la douleur, les démangeaisons et divers troubles des nerfs périphériques 5,6,7,8,9,10,11,12,13.

Protocole

Pour la présente étude, les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’UCSF et ont été menées conformément au guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris mâles et femelles C57BL/6 adultes, âgées de 8 à 12 semaines (élevées en interne) ont été utilisées ici.

1. Préparation de l’échantillon DRG

1. Anesthésier les souris avec 2,5 % d’Avertin (voir le tableau des matériaux). Assurer une anesthésie adéquate par l’absence de réponse à la stimulation douloureuse. Perfuser les animaux par v....

Résultats

La présente étude a recueilli environ 16 coupes de DRG continues et de haute qualité à partir d’un DRG L4 de souris. Les sections obtenues étaient sans aucune distorsion. La figure 1 illustre la procédure étape par étape pour la cryosection. L’élimination de l’excès de liquide des coupes de tissu est illustrée à la figure 2. Le processus d’intégration des tissus dans le cadre de l’OCT est mis en évidence à la figure 3.

Discussion

Ce protocole fournit une procédure simple, étape par étape, pour la section cryostatique du DRG de souris afin d’obtenir des sections DRG de haute qualité sur des lames de manière fiable. Il y a quatre étapes critiques dans ce protocole. Tout d’abord, l’échantillon DRG et la pince à épiler doivent être secs avant de placer l’échantillon DRG sur l’OCT de base. Tout liquide entourant l’échantillon DRG formera une coquille de glace autour de celui-ci, ce qui entraînera la séparation des sections DRG de l’OCT et leur courbur.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthésie l’éprédia animale
; Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm de diamètre Hachuré	Fisherbrand	1910	Tenez la section OCT en bas  ;
Ergo Pince à épiler	Fisherbrand	S95310	À l’aide de l’extrémité d’une pince à épiler pour toucher doucement le fond (6 o' horloge) de la section de manière à ce qu’elle adhère à la surface de la plate-forme pour éviter que la section ne se courbe vers l’arrière dans un roulis  ;
Fisherbrand  ; Lames de microscope Superfrost Plus	Fisherbrand	1255015	Pour collecter la section DRG.
Marqueurs	Fisherbrand	133794	; Marquez l’orientation de la base OCT
Scigen  ; Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	; 23730571	Milieu d’enrobage pour les échantillons de tissus congelés afin d’assurer une température de coupe optimale (O.C.T.).