En procedure for mus dorsal rod ganglion kryosektionering
Summary
Præsenteret her er udviklingen for konsekvent at erhverve højkvalitets dorsal rod ganglion kryostatsektioner.
Abstract
Højkvalitets mus dorsal rod ganglion (DRG) kryostat sektioner er afgørende for korrekt immunkemi farvning og RNAscope undersøgelser i forskningen af inflammatoriske og neuropatiske smerter, kløe, samt andre perifere neurologiske tilstande. Det er dog stadig en udfordring konsekvent at opnå intakte og flade kryostatsektioner af høj kvalitet på glasglas på grund af DRG-vævets lille prøvestørrelse. Indtil videre er der ingen artikel, der beskriver en optimal protokol til DRG-kryosektionering. Denne protokol præsenterer en trinvis metode til at løse de ofte opståede vanskeligheder forbundet med DRG-kryosektion. Den præsenterede artikel forklarer, hvordan man fjerner den omgivende væske fra DRG-vævsprøverne, placerer DRG-sektionerne på diaset vendt mod samme retning og flader sektionerne på glasglasset uden at bue op. Selvom denne protokol er udviklet til kryosektionering af DRG-prøverne, kan den anvendes til kryosektionering af mange andre væv med en lille prøvestørrelse.
Introduction
Dorsalrodganglionen (DRG) indeholder de primære sensoriske neuroner, vævsmakrofagerne og satellitcellerne, der omgiver de primære sensoriske neuroner 1,2,3,4. Det er en vigtig anatomisk struktur i behandlingen af uskadelige og skadelige signaler og spiller kritiske roller i smerte, kløe og forskellige perifere nervesygdomme 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Selvom der er udviklet flere metoder til at dissekere DRG-væv fra musens rygmarv14,15,16, er kryosektionering af DRG-vævet fortsat udfordrende, da DRG-vævet er ret lille, og kryostatsektioner af DRG-prøver har tendens til at kurve i ruller, hvilket gør det vanskeligt at overføre kryostatsektionerne korrekt til glasglas. Imidlertid er korrekt kryosektion af DRG-vævet afgørende for immunhistokemiske undersøgelser og strukturen af DRG-sensoriske neuroner 17,18,19,20,21,22,23. Da enkeltcellede RNA-sekventeringsresultater desuden har afsløret den bemærkelsesværdige heterogenitet af DRG-sensoriske neuroner hos både mennesker24 og mus25, er korrekt kryosektion af DRG-væv afgørende for at undersøge forskellige DRG-cellers funktionelle rolle under forskellige fysiologiske og patologiske tilstande.
Selvom vævsrensningsteknikken er blevet anvendt til at undersøge 3D-rekonstruktionen af DRG26 som en alternativ teknik til kryosektion af DRG, er vævsrensningsteknikken tids- og arbejdskrævende. Til sammenligning er kryosektion af DRG hurtig og relativt let at udføre, og det er derfor fortsat en nøgleteknik til immunhistokemi og strukturstudier af DRG og andre regioner i centralnervesystemet. Imidlertid er det stadig en udfordring at opnå intakte og flade kryostatsektioner af høj kvalitet på glasglas i neurovidenskabelig forskning på grund af den lille prøvestørrelse af væv, som DRG og visse hjerneområder, og der er ingen artikel, der beskriver den optimale protokol på dette tidspunkt til kryosektionering af små vævsprøver, såsom muse-DRG’er.
Denne protokol giver en nem, trin-for-trin teknik til kryostatsektionering af musens DRG for pålideligt at opnå så mange DRG-sektioner af høj kvalitet på diasene til efterfølgende DRG-undersøgelser. Selvom den er specielt designet til kryosektionering af DRG-prøver, kan denne teknik potentielt bruges til kryosektionering af forskellige andre væv med en lille prøvestørrelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol giver en nem trin-for-trin procedure til kryostatsektionering af musens DRG for pålideligt at opnå DRG-sektioner af høj kvalitet på dias. Der er fire kritiske trin i denne protokol. Først skal DRG-prøven og pincetten være tørre, før DRG-prøven lægges på basis-OLT. Enhver væske, der omgiver DRG-prøven, vil danne en isskal omkring den, hvilket resulterer i, at DRG-sektioner adskilles fra OCT og buer op. For det andet, hvis aluminiumsblokken ikke har et mærke, eller hvis basen OCT dækker mærk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
References
- Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
- Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).
- Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
- Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).
- Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
- Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
- Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052 (2020).
- Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
- Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
- Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
- Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
- Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
- Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).
- Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).
- Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
- Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
- Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
- Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).
- Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
- Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
- Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752 (2021).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).
