Presentert her er utviklingen for konsekvent å anskaffe høykvalitets dorsalrot ganglion kryostatseksjoner.
Høykvalitets mus dorsal root ganglion (DRG) kryostatseksjoner er avgjørende for riktig immunkjemifarging og RNAscope-studier i forskningen av inflammatorisk og nevropatisk smerte, kløe, så vel som andre perifere nevrologiske tilstander. Det er imidlertid fortsatt en utfordring å konsekvent oppnå høy kvalitet, intakte og flate kryostatseksjoner på glassglass på grunn av den lille prøvestørrelsen på DRG-vevet. Så langt er det ingen artikkel som beskriver en optimal protokoll for DRG-kryoseksjonering. Denne protokollen presenterer en trinnvis metode for å løse de ofte oppståtte vanskelighetene forbundet med DRG-kryoseksjonering. Den presenterte artikkelen forklarer hvordan du fjerner den omkringliggende væsken fra DRG-vevsprøvene, plasserer DRG-seksjonene på lysbildet mot samme retning og flater seksjonene på glasslysbildet uten å bøye seg. Selv om denne protokollen er utviklet for kryoseksjonering av DRG-prøvene, kan den brukes til kryoseksjonering av mange andre vev med liten prøvestørrelse.
Dorsal root ganglion (DRG) inneholder de primære sensoriske nevronene, vevsmakrofagene og satellittcellene som omgir de primære sensoriske nevronene 1,2,3,4. Det er en viktig anatomisk struktur i behandling av uskyldige og skadelige signaler, og spiller kritiske roller i smerte, kløe og ulike perifere nervesykdommer 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Selv om flere metoder har blitt utviklet for å dissekere DRG-vev fra musens ryggmarg14,15,16, er kryoseksjonering av DRG-vevet fortsatt utfordrende da DRG-vevet er ganske lite, og kryostatseksjoner av DRG-prøver har en tendens til å bøye seg i ruller, noe som gjør det vanskelig å overføre kryostatseksjonene på riktig måte på glassglass. Imidlertid er riktig kryoseksjonering av DRG-vevet avgjørende for immunhistokjemiske studier og strukturen til DRG sensoriske nevroner 17,18,19,20,21,22,23. Videre, ettersom enkeltcelle RNA-sekvenseringsresultater har avslørt den bemerkelsesverdige heterogeniteten til DRG-sensoriske nevroner hos både mennesker24 og mus25, er riktig kryoseksjonering av DRG-vev avgjørende for å undersøke den funksjonelle rollen til forskjellige DRG-celler i forskjellige fysiologiske og patologiske forhold.
Selv om vevsryddingsteknikken har blitt brukt til å undersøke 3D-rekonstruksjonen av DRG26 som en alternativ teknikk for kryoseksjonering av DRG, er vevsryddingsteknikken tid- og arbeidskrevende. Til sammenligning er kryoseksjonering av DRG rask og relativt enkel å utføre, og dermed gjenstår det å være en nøkkelteknikk for immunhistokjemi og strukturstudier av DRG og andre regioner i sentralnervesystemet. Imidlertid er det fortsatt en utfordring å oppnå høykvalitets, intakte og flate kryostatseksjoner på glassglass på nevrovitenskapelig forskning på grunn av den lille prøvestørrelsen på vev, som DRG og visse hjernegrupper, og det er ingen artikkel som beskriver den optimale protokollen på dette punktet for kryoseksjonering av små vevsprøver, for eksempel muse-DRG.
Denne protokollen gir en enkel, trinnvis teknikk for kryostatseksjonering av musens DRG for pålitelig å oppnå så mange høykvalitets DRG-seksjoner på lysbildene for påfølgende DRG-studier. Mens den er spesielt utviklet for kryoseksjonering av DRG-prøver, kan denne teknikken potensielt brukes til kryoseksjonering av forskjellige andre vev med liten prøvestørrelse.
Denne protokollen gir en enkel trinnvis prosedyre for kryostatseksjonering av musens DRG for å oppnå DRG-seksjoner av høy kvalitet på lysbilder pålitelig. Det er fire kritiske trinn i denne protokollen. Først må DRG-prøven og pinsetten være tørr før du legger DRG-prøven på basen OCT. Enhver væske som omgir DRG-prøven vil danne et isskall rundt den, noe som resulterer i DRG-seksjoner som skiller seg fra OCT og bøyer seg. For det andre, hvis aluminiumsblokken ikke har et merke, eller hvis basen OCT dekker m…
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |