Ex Vivo Imagem Multimodal Baseada em OCT de Olhos de Doadores Humanos para Pesquisa em Degeneração Macular Relacionada à Idade

Summary

Os ensaios laboratoriais podem alavancar o valor prognóstico da imagem multimodal baseada em tomografia de coerência óptica longitudinal (OCT) da degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Olhos de doadores humanos com e sem DMRI são fotografados usando OCT, oftalmoscopia a laser de varredura por reflectância no infravermelho próximo e autofluorescência em dois comprimentos de onda de excitação antes da secção do tecido.

Abstract

Uma sequência de progressão para degeneração macular relacionada à idade (DMRI) aprendida com imagens clínicas multimodais (MMI) baseadas em tomografia de coerência óptica (OCT) poderia adicionar valor prognóstico aos achados laboratoriais. Neste trabalho, OCT e IHM ex vivo foram aplicados em olhos de doadores humanos antes da secção do tecido da retina. Os olhos foram recuperados de doadores brancos não diabéticos com idade ≥80 anos, com tempo de morte até a preservação (DPP) de ≤6 h. Os globos foram recuperados no local, marcados com trefina de 18 mm para facilitar a remoção da córnea e imersos em paraformaldeído tamponada a 4%. As imagens de fundo de olho coloridas foram adquiridas após a remoção do segmento anterior com um telescópio dissecante e uma câmera SLR usando iluminação trans, epi e flash em três aumentos. Os globos foram colocados em um tampão dentro de uma câmara personalizada com uma lente de 60 dioptrias. Eles foram imageados com OCT de domínio espectral (cubo de mácula de 30°, espaçamento de 30 μm, média = 25), reflectância no infravermelho próximo, autofluorescência de 488 nm e autofluorescência de 787 nm. Os olhos com DMRI apresentavam alteração do epitélio pigmentado da retina (EPR), com depósitos drusenoides drusenoides (DDS) drusenóides (DRS) drusenos ou sub-retinianos, com ou sem neovascularização, e sem evidência de outras causas. Entre junho de 2016 e setembro de 2017, foram recuperados 94 olhos direitos e 90 esquerdos (DtoP: 3,9 ± 1,0 h). Dos 184 olhos, 40,2% tinham DMRI, incluindo DMRI intermediária precoce (22,8%), atrófica (7,6%) e neovascular (9,8%), e 39,7% tinham máculas normais. Drusen, SDDs, focos hiper-reflexivos, atrofia e cicatrizes fibrovasculares foram identificados usando OCT. Os artefatos incluíram opacificação tecidual, descolamentos (bacilar, retiniano, EPR, coroidal), alteração cística foveal, EPR ondulante e dano mecânico. Para guiar a criossecção, volumes de OCT foram usados para encontrar os pontos de referência da fóvea e da cabeça do nervo óptico e patologias específicas. Os volumes ex vivo foram registrados com os volumes in vivo , selecionando-se a função de referência para rastreamento ocular. A visibilidade ex vivo da patologia observada in vivo depende da qualidade da preservação. Dentro de 16 meses, 75 olhos de doadores rápidos DtoP em todos os estágios da DMRI foram recuperados e estadiados usando métodos clínicos de MMI.

Introduction

Quinze anos de manejo da degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI) com terapia anti-VEGF sob a orientação da tomografia de coerência óptica (OCT) ofereceram novos insights sobre a sequência de progressão e a microarquitetura dessa causa prevalente de perda de visão. Um reconhecimento importante é que a DMRI é uma doença tridimensional que envolve a retina neurossensorial, o epitélio pigmentado da retina (EPR) e a coroide. Como resultado das imagens de OCT de pacientes do estudo e dos olhos de pacientes clínicos tratados, as características da patologia além daquelas vistas pela fotografia de fundo de olho colorido, um padrão clínico por décadas, são agora reconhecidas. Estes incluem neovascularização intrarretiniana (neovascularização macular tipo 3¹, anteriormente proliferação angiomatosa), depósitos drusenoides sub-retinianos (SDDs, também chamados pseudodrusen reticulares)², múltiplas vias do destino do EPR^3,4 e células de Müller intensamente glióticas em atrofia ^5,6.

Sistemas modelo desprovidos de máculas (células e animais) recriam algumas fatias dessa complexa doença ^7,8,9. Mais sucesso em melhorar a carga da DMRI poderia vir da descoberta e exploração da patologia primária em olhos humanos, entendendo a composição celular única da mácula, seguida de tradução para sistemas modelo. Este relatório retrata uma colaboração de três décadas entre um laboratório de pesquisa acadêmica e um banco de olhos. Os objetivos dos métodos de caracterização tecidual aqui descritos são dois: 1) informar a evolução da tecnologia diagnóstica, demonstrando a base da aparência do fundo de olho e fontes de sinal de imagem com microscopia, e 2) classificar espécimes de DMRI para técnicas de descoberta molecular direcionadas (imunohistoquímica) e não direcionadas (espectrometria de massa por imagem, IMS e transcriptômica espacial) que preservam a fóvea somente cônica e a para- e perifovea ricas em bastonetes. Tais estudos poderiam acelerar a tradução para OCT clínica, para a qual uma sequência de progressão e acompanhamento longitudinal são possíveis por meio do rastreamento ocular. Essa tecnologia, projetada para monitorar os efeitos do tratamento, registra exames de uma consulta clínica para outra usando vasos da retina. Associar a OCT rastreada pelos olhos aos resultados laboratoriais obtidos com técnicas destrutivas poderia fornecer um novo nível de valor prognóstico aos achados moleculares.

Em 1993, o laboratório de pesquisa capturou fotografias coloridas de fundo de olho post-mortem no filme¹⁰. Esse esforço foi inspirado na soberba fotomicroscopia e histologia da retina periférica humana de Foos e colaboradores11,12,13 e nas extensas correlações clínico-patológicas da DMRI de Sarks et al.14,15. A partir de 2009, a imagem multimodal (IHM) ex vivo ancorada na OCT de domínio espectral foi adotada. Essa transição foi inspirada pelos esforços semelhantes de outros 16,17 e, principalmente, pela constatação de que grande parte da ultraestrutura descrita pelos Sarks estava disponível em três dimensões, ao longo do tempo, na clínica ^18,19. O objetivo era adquirir olhos com máculas aderidas em um prazo razoável para estudos bem fundamentados dos fenótipos em nível celular na retina, PSE e coroide. A intenção era ir além da estatística “por olho” para “por tipo de lesão”, padrão influenciado pelos conceitos de “placa vulnerável” das doenças^{cardiovasculares20,21}.

O protocolo deste relato reflete a experiência com cerca de 400 pares de olhos doadores acessados em vários fluxos. Em 2011-2014, foi criado o site do Projeto MACULA de histopatologia da AMD, que inclui espessuras de camadas e anotações de 142 espécimes arquivados. Esses olhos foram preservados de 1996 a 2012 em fixador de glutaraldeído-paraformaldeído para histologia de alta resolução de resina epóxi e microscopia eletrônica. Todos os fundos de fundo foram fotografados coloridos quando recebidos e refotografados pela OCT imediatamente antes da histologia. Um suporte ocular originalmente projetado para estudos do nervo óptico²² foi usado para acomodar um punch de tecido de espessura total de 8 mm de diâmetro centrado na fóvea. OCT B-scans através do centro foveal e um local 2 mm superior, correspondente à histologia nos mesmos níveis, foram enviados para o site, além de uma fotografia de fundo de olho colorida. A escolha dos planos da OCT foi ditada pela proeminência da patologia da DMRI sob a fóvea²³ e pela proeminência dos SDDs em áreas ricas em bastonetes superiores à fóvea^24,25.

A partir de 2013, olhos com MMI ancorados em OCT durante a vida estavam disponíveis para correlações clinicopatológicas diretas. A maioria (7 de 10 doadores) envolveu pacientes em uma clínica de referência de retina (autor: K.B.F.), que oferecia um registro diretivo avançado para pacientes interessados em doar seus olhos após a morte para fins de pesquisa. Os olhos foram recuperados e preservados pelo banco de olhos local, transferidos para o laboratório e preparados da mesma forma que os olhos do Projeto MACULA. Os volumes clínicos de OCT pré-mortem foram lidos perfeitamente em laboratório, alinhando as características patológicas observadas durante a vida com as características vistas ao microscópio²⁶.

A partir de 2014, a coleta prospectiva de olhos começou pela triagem para DMRI em olhos de doadores sem história clínica, mas preservados durante um limite de tempo definido (6 h). Para isso, o suporte para os olhos foi modificado para acomodar um globo inteiro. Isso reduziu a chance de descolamento ao redor das bordas de corte do punch de 8 mm usado anteriormente. Os olhos foram preservados em paraformaldeído tamponado a 4% para imunohistoquímica e transferidos para 1% no dia seguinte para armazenamento a longo prazo. Em 2016-2017 (pré-pandemia), foram recuperados 184 olhos de 90 doadores. As estatísticas e imagens deste relatório são geradas a partir desta série. Durante a era pandêmica (lockdowns e consequências de 2020), as coletas prospectivas para colaborações transcriptômicas e IMS continuaram em um ritmo reduzido, essencialmente usando os métodos de 2014.

Outros métodos para avaliação ocular do doador estão disponíveis. O Minnesota Grading System (MGS)^27,28 é baseado no sistema clínico AREDS para fotografia de fundo de olho^colorido29. As limitações desse método incluem a combinação de DMRI atrófica e neovascular em um estágio de “DMRI tardia”. Além disso, a MGS envolve a remoção da retina neurossensorial antes da fotodocumentação da coroide do EPR. Essa etapa desloca os DDS em graus variados^30,31 e remove a correspondência espacial da retina externa e seu sistema de suporte. Assim, esforços para relacionar a demanda metabólica e a sinalização da retina à patologia na PSE-coróide podem ser impedidos. O Sistema Utah implementou a MMI usando fotografia colorida ex vivo e OCT para categorizar os olhos destinados à dissecção em regiões para extração de RNA e proteína³². Embora preferível às extrações inteiras da ocular, a área de 3 mm de diâmetro com maior risco de progressão da DMRI^33,34 representa apenas 25% de um punch centrado na fóvea de 6 mm de diâmetro. Assim, técnicas que possam localizar achados referentes à fóvea, como cortes seriados para imuno-histoquímica, são vantajosas.

Protocol

O comitê de revisão institucional da Universidade do Alabama em Birmingham aprovou os estudos laboratoriais, que aderiram às Boas Práticas de Laboratório e Nível de Biossegurança 2/2+. Todos os bancos de olhos dos EUA estão em conformidade com o Uniform Anatomical Gifts Act de 2006 e a Food and Drug Administration dos EUA. A maioria dos bancos de olhos dos EUA, incluindo a Advancing Sight Network, está em conformidade com os padrões médicos da Eye Bank Association of America. A <str…

Representative Results

A Tabela 1 mostra que, durante 2016-2017, foram recuperados 184 olhos de 94 doadores brancos não diabéticos >80 anos de idade. O tempo médio de morte até a preservação foi de 3,9 h (variação: 2,0-6,4 h). Dos 184 olhos revisados, 75 (40,2%) apresentavam DMRI alguma. Foram identificadas as seguintes categorias: Pouco notável (39,7%), Questionável (11,4%), DMRI Intermediário Precoce (22,8%), Atrófica (7,6%), Neovascular (9,8%), Outros (8,7%) e Ignorado/Não Registrado/Não Graduável (<1%). <str…

Discussion

Usando uma abordagem de triagem de base populacional durante um período de 16 meses na era pré-COVID, foi possível obter 75 olhos de doadores com DMRI. Todos foram recuperados com uma DtoP curta e estadiados usando MMI ancorado em OCT. O critério de idade (>80 anos) está fora da faixa etária típica para recuperações teciduais destinadas a córneas transplantáveis. Apesar da idade avançada, nossos critérios resultaram em olhos em todos os estágios da DMRI. Muitos fenótipos de EPR são comuns a todos os está…

Materials

Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12