Protokollet beskriver metodiken för extracellulär registrering i den motoriska cortex (MC) för att avslöja extracellulära elektrofysiologiska egenskaper hos fritt rörliga medvetna möss, samt dataanalys av lokala fältpotentialer (LFP) och spikar, vilket är användbart för att utvärdera nätverkets neurala aktivitet som ligger till grund för beteenden av intresse.
Protokollet syftar till att avslöja egenskaperna hos neuronal avfyrning och nätverkslokala fältpotentialer (LFP) i möss som beter sig som utför specifika uppgifter genom att korrelera de elektrofysiologiska signalerna med spontant och/eller specifikt beteende. Denna teknik representerar ett värdefullt verktyg för att studera den neuronala nätverksaktivitet som ligger bakom dessa beteenden. Artikeln ger en detaljerad och komplett procedur för elektrodimplantation och därav följande extracellulär registrering i fritt rörliga medvetna möss. Studien inkluderar en detaljerad metod för att implantera mikroelektrodmatriserna, fånga LFP och neuronala spiksignaler i motorcortex (MC) med hjälp av ett flerkanalssystem och den efterföljande offline-dataanalysen. Fördelen med flerkanalsinspelning hos medvetna djur är att ett större antal spikande neuroner och neuronala subtyper kan erhållas och jämföras, vilket möjliggör utvärdering av förhållandet mellan ett specifikt beteende och de associerade elektrofysiologiska signalerna. Framför allt kan den flerkanaliga extracellulära inspelningstekniken och dataanalysproceduren som beskrivs i den aktuella studien tillämpas på andra hjärnområden när man utför experiment på möss som beter sig.
Den lokala fältpotentialen (LFP), en viktig komponent i extracellulära signaler, återspeglar den synaptiska aktiviteten hos stora populationer av neuroner, som bildar den neurala koden för flera beteenden1. Spikar som genereras av neuronal aktivitet anses bidra till LFP och är viktiga för neural kodning2. Förändringar i spikar och LFP har visat sig förmedla flera hjärnsjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, såväl som känslor som rädsla, etc.3,4. Det är värt att notera att många studier har visat att spikaktiviteten skiljer sig avsevärt mellan vaket och bedövat tillstånd hos djur5. Även om inspelningar i sövda djur erbjuder en möjlighet att bedöma LFP med minimala artefakter i högt definierade kortikala synkroniseringstillstånd, skiljer sig resultaten till viss del från vad som kan hittas hos vakna försökspersoner 6,7,8. Således är det mer meningsfullt att detektera neural aktivitet över långa tidsskalor och stora rumsliga skalor vid olika sjukdomar i ett vaket hjärntillstånd med hjälp av elektroder implanterade i hjärnan. Detta manuskript ger information för nybörjare om hur man gör mikrodrivsystemet och ställer in parametrarna med hjälp av vanlig programvara för att beräkna spik- och LFP-signalerna på ett snabbt och enkelt sätt för att få igång inspelningen och analysen.
Även om den icke-invasiva registreringen av hjärnfunktioner, t.ex. genom att använda elektroencefalogram (EEG) och händelserelaterade potentialer (ERP) som registreras från skalpen, har använts i stor utsträckning i studier på människor och gnagare, har EEG- och ERP-data låga rumsliga och tidsmässiga egenskaper och kan därför inte detektera de exakta signalerna som produceras av närliggande dendritisk synaptisk aktivitet inom ett specifikt hjärnområde1. För närvarande, genom att dra nytta av flerkanalsregistrering hos medvetna djur, kan neural aktivitet i de djupare lagren av hjärnan registreras kroniskt och progressivt genom att implantera ett mikrodrivsystem i hjärnan på primater eller gnagare under flera beteendetester 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . I korthet kan forskare konstruera ett mikrodrivsystem som kan användas för oberoende positionering av elektroder eller tetroder för att rikta in sig på olika delar av hjärnan10,11. Till exempel beskrev Chang et al. tekniker för att registrera spikar och LFP:er i möss genom att sätta ihop en lätt och kompakt mikroenhet12. Dessutom finns mikrobearbetade kiselsonder med specialtillverkade tillbehörskomponenter kommersiellt tillgängliga för registrering av flera enskilda neuroner och LFP:er hos gnagare under beteendeuppgifter13. Även om olika konstruktioner har använts för att montera mikrodrivsystem, har dessa fortfarande begränsad framgång när det gäller komplexiteten och vikten hos hela mikrodrivsystemet. Till exempel visade Lansink et al. ett flerkanaligt mikrodrivsystem med en komplex struktur för inspelning från en enda hjärnregion14. Sato et al. rapporterade om ett flerkanaligt mikrodrivsystem som visade en automatisk hydraulisk positioneringsfunktion15. De största nackdelarna med dessa mikrodrivsystem är att de är för tunga för att möss ska kunna röra sig fritt och är svåra att montera för nybörjare. Även om flerkanalig extracellulär inspelning har visat sig vara en lämplig och effektiv teknik för att mäta neural aktivitet under beteendetester, är det inte lätt för nybörjare att spela in och analysera signalerna som förvärvas av det komplexa mikrodrivsystemet. Med tanke på att det är svårt att få igång hela driftprocessen för flerkanalig extracellulär inspelning och dataanalys i fritt rörliga möss16,17, presenterar denna artikel förenklade riktlinjer för att introducera den detaljerade processen för att göra mikrodrivsystemet med hjälp av allmänt tillgängliga komponenter och inställningar; parametrarna i den vanliga programvaran för att beräkna spik- och LFP-signalerna på ett snabbt och enkelt sätt tillhandahålls också. Dessutom, i detta protokoll, kan musen röra sig fritt på grund av användningen av en heliumballong, vilket bidrar till att kompensera vikten av huvudstage och mikrodrivsystem. Generellt beskriver vi i denna studie hur man enkelt bygger ett mikrodrivsystem och optimerar processerna för registrering och dataanalys.
Flerkanalsinspelning i möss som rör sig fritt har ansetts vara en användbar teknik inom neurovetenskapliga studier, men det är fortfarande ganska utmanande för nybörjare att spela in och analysera signalerna. I den aktuella studien ger vi förenklade riktlinjer för att göra mikrodrivsystem och utföra elektrodimplantation, samt förenklade procedurer för att fånga och analysera de elektriska signalerna via spiksorteringsprogramvara och programvara för neurofysiologisk dataanalys.
<p class="jove_co…The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (31871170, 32170950 och 31970915), Natural Science Foundation of Guangdong Province (2021A1515010804 och 2023A1515010899), Guangdong Natural Science Foundation for Major Cultivation Project (2018B030336001) och Guangdong Grant: Key Technologies for Treatment of Brain Disorders (2018B030332001).
2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |