Synthèse directe de nanoparticules d’or EM-visibles dans des cellules pour l’analyse de localisation des protéines avec une ultrastructure bien préservée
Summary
Le présent protocole décrit une technologie clonable de marquage par microscopie électronique pour détecter les protéines marquées par la métallolothionéine dans les cellules à l’aide d’une nouvelle technique de synthèse de nanoparticules d’or basée sur le mécanisme d’autonucléation.
Abstract
L’analyse de la localisation précise des molécules de protéines dans les cellules à résolution ultrastructurale est d’une grande importance pour l’étude de divers processus physiologiques ou pathologiques dans tous les organismes vivants. Par conséquent, le développement de marqueurs clonables pouvant être utilisés comme sondes de microscopie électronique est d’une grande valeur, tout comme les protéines fluorescentes ont joué un rôle crucial dans le domaine de l’imagerie optique. Le mécanisme de suppression de l’autonucléation (ANSM) a récemment été découvert, qui permet la synthèse spécifique de nanoparticules d’or (AuNPs) sur des marqueurs riches en cystéine, tels que la métallothionéine (MT) et la protéine antigel (AFP).
Sur la base de l’ANSM, une technologie de marquage en microscopie électronique a été développée, qui permet la détection spécifique de protéines marquées dans les cellules procaryotes et eucaryotes avec une efficacité de marquage sans précédent. Cette étude illustre un protocole de détection des protéines de fusion MTn (une variante modifiée de la MT dépourvue de résidus réactifs aux aldéhydes) dans des cellules de mammifères à ultrastructure bien préservée. Dans ce protocole, la congélation à haute pression et la fixation par substitution de congélation ont été réalisées à l’aide de fixateurs non aldéhydiques (tels que l’acide tannique, l’acétate d’uranyle) pour préserver l’ultrastructure quasi native et éviter d’endommager l’activité du marqueur causée par la réticulation des aldéhydes.
Une simple réhydratation en une étape a été utilisée avant la synthèse AuNP basée sur l’ANSM. Les résultats ont montré que les protéines marquées ciblaient divers organites, y compris les membranes et la lumière du réticulum endoplasmique (RE), et les matrices mitochondriales ont été détectées avec une efficacité et une spécificité élevées. Cette recherche fournit aux biologistes un protocole robuste pour répondre à une vaste gamme de questions biologiques au niveau d’une seule molécule dans des contextes ultrastructuraux cellulaires.
Introduction
À l’ère postgénomique, le développement de la protéine fluorescente verte (GFP) en tant que rapporteur à molécule unique pour la microscopie optique a révolutionné le domaine de la recherche moderne en sciences de la vie 1,2. Pendant des décennies, la microscopie électronique (EM) a été un outil puissant pour observer intuitivement l’ultrastructure cellulaire avec une résolution nanométrique3; Cependant, l’identification et la localisation précises des molécules de protéines restent difficiles.
La technique de marquage EM la plus couramment utilisée est la technique de marquage par microscopie immunoélectronique (IEM), qui est basée sur la réaction antigène-anticorps. Cependant, bien que de nombreuses techniques aient été développées dans le domaine du marquage IEM, y compris le pré-encastrement IEM et le post-enrobage IEM (sur des coupes de résine ou des cryosections hydratées), il souffre encore d’une faible efficacité de marquage (<10%)4,5, qui est liée à la préparation de l’échantillon et à la qualité des anticorps. Pour surmonter ces limitations, le développement de balises génétiquement codées a un grand potentiel d’application.
Deux principaux types d’étiquettes EM ont été explorés en profondeur ces dernières années. Un type est la méthode de coloration DAB, qui utilise des marqueurs tels que APEX2 pour oxyder la 3,3′-diaminobenzidine (DAB) en polymères osmiophiles pour la visualisation EM 6,7,8,9,10,11,12. Il permet le marquage de protéines à forte abondance dans les régions subcellulaires, mais ne convient pas au comptage d’une seule molécule. L’autre type utilise des protéines de liaison aux métaux, telles que la ferritine 13 et la métallothionéine (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, pour générer des dépôts métalliques denses en électrons dans situ pour la visualisation EM. Seul ce dernier a un réel potentiel pour la visualisation et le comptage d’une seule molécule. La taille moléculaire de la ferritine est trop grande (~450 kD) pour qu’elle puisse être utilisée comme étiquette prometteuse, alors que la petite taille (~5 kD) de la MT et sa capacité à lier divers ions à travers ses 20 cystéines ont attiré une grande attention. Plusieurs laboratoires ont essayé de marquer des protéines de fusion MT purifiées ou des cellules exprimant MT en incubant directement avec Au+. Ces tentatives ont initialement prouvé que les marqueurs MT peuvent lier les ions d’or pour former des signaux à contraste élevé, mais aucun n’a vraiment permis l’identification efficace de protéines individuelles dans les cellules, et ils ne sont pas largement applicables 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
La technique de synthèse AuNP basée sur l’ANSM, qui consiste à synthétiser des AuNP de taille 2-6 nm directement sur des marqueurs riches en cystéine (par exemple, MT, les variantes MTn et MTα, AFP) en tant que marqueurs denses en électrons pour la visualisation EM, est la première approche fiable et applicable pour le marquage des protéines et la détection de molécules uniques dans les cellules24,25,26. Il permet la synthèse spécifique d’AuNP sur des protéines de fusion de marqueurs isolées et a atteint une efficacité de marquage sans précédent dans les cellules procaryotes (E. coli) et eucaryotes (S. pombe) non fixées ou chimiquement fixées. Cependant, la mise en œuvre du même protocole dans des systèmes plus avancés tels que les cellules de mammifères ou même les tissus implique des défis supplémentaires, tels que l’homéostasie redox intracellulaire plus complexe et une structure cellulaire plus fragile.
Cette étude présente une technologie de marquage EM clonable, qui combine la nouvelle technique de synthèse AuNP basée sur ANSM pour marquer les marqueurs riches en cystéine (MT) génétiquement codés avec la méthode de préparation d’échantillons HPF / FSF / réhydratation / HPF / FSF, permet l’identification sans ambiguïté d’une seule molécule de protéines marquées dans la membrane ER, la lumière ER et la matrice mitochondriale dans les cellules HeLa. La méthode actuelle combine les caractéristiques d’une efficacité d’étiquetage élevée, d’un rapport signal sur bruit élevé, d’un marquage à molécule unique et d’une forte universalité, et cette méthode a de larges perspectives d’application dans la recherche en sciences de la vie.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude présente ici une technologie robuste de marquage EM clonable pour la visualisation à molécule unique de molécules de protéines dans l’environnement cellulaire avec une résolution ultrastructurale. Les AuNPs directement synthétisés sur des marqueurs riches en cystéine génétiquement codés fournissent une localisation claire et précise des protéines cibles. La technique de congélation à haute pression et de remplacement de la congélation préserve parfaitement l’ultrastructure des échantillo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le protocole décrit ici est dérivé de l’article publié par Jiang et al. (2020). Ce travail a été soutenu par des subventions du MOST (973 programmes n° 2011CB812502 et 2014CB849902) et par le soutien financier du gouvernement municipal de Beijing.
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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