Direkte Synthese von EM-sichtbaren Gold-Nanopartikeln in Zellen zur Proteinlokalisierungsanalyse mit gut erhaltener Ultrastruktur
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine klonierbare elektronenmikroskopische Markierungstechnologie zum Nachweis von Metallothionein-markierten Proteinen in Zellen unter Verwendung einer neuartigen, auf dem Mechanismus der Autonukleationsunterdrückung basierenden Gold-Nanopartikel-Synthesetechnik.
Abstract
Die Analyse der präzisen Lokalisation von Proteinmolekülen in Zellen mit ultrastruktureller Auflösung ist von großer Bedeutung für die Untersuchung verschiedener physiologischer oder pathologischer Prozesse in allen lebenden Organismen. Daher ist die Entwicklung klonbarer Tags, die als elektronenmikroskopische Sonden verwendet werden können, von großem Wert, so wie fluoreszierende Proteine im Bereich der optischen Bildgebung eine entscheidende Rolle gespielt haben. Kürzlich wurde der Mechanismus zur Unterdrückung der Autonukleation (ANSM) aufgedeckt, der die spezifische Synthese von Goldnanopartikeln (AuNPs) auf Cystein-reichen Markern wie Metallothionein (MT) und Antifreeze Protein (AFP) ermöglicht.
Basierend auf dem ANSM wurde eine elektronenmikroskopische Markierungstechnologie entwickelt, die den spezifischen Nachweis von markierten Proteinen in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen mit einer bisher unerreichten Markierungseffizienz ermöglicht. Diese Studie veranschaulicht ein Protokoll für den Nachweis von MTn-Fusionsproteinen (einer technisch hergestellten MT-Variante, der aldehydreaktive Rückstände fehlen) in Säugetierzellen mit gut erhaltener Ultrastruktur. In diesem Protokoll wurden Hochdruckgefrieren und Gefriersubstitutionsfixierung unter Verwendung von Nicht-Aldehyd-Fixiermitteln (wie Gerbsäure, Uranylacetat) durchgeführt, um die nahezu native Ultrastruktur zu erhalten und eine Schädigung der Tag-Aktivität durch Aldehydvernetzung zu vermeiden.
Vor der ANSM-basierten AuNP-Synthese wurde eine einfache einstufige Rehydrierung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die markierten Proteine auf verschiedene Organellen abzielten, einschließlich der Membranen und des Lumens des endoplasmatischen Retikulums (ER), und mitochondriale Matrizen wurden mit hoher Effizienz und Spezifität detektiert. Diese Forschung bietet Biologen ein robustes Protokoll, um eine enorme Bandbreite biologischer Fragestellungen auf Einzelmolekülebene in zellulären ultrastrukturellen Kontexten zu beantworten.
Introduction
In der postgenomischen Ära hat die Entwicklung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als Einzelmolekül-Reporter für die Lichtmikroskopie das Feld der modernen lebenswissenschaftlichen Forschung revolutioniert 1,2. Die Elektronenmikroskopie (EM) ist seit Jahrzehnten ein leistungsfähiges Werkzeug zur intuitiven Beobachtung der zellulären Ultrastruktur mit nanoskaliger Auflösung3; Die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Proteinmolekülen bleibt jedoch eine Herausforderung.
Die am häufigsten verwendete EM-Markierungstechnik ist die Immunelektronenmikroskopie (IEM)-Markierungstechnik, die auf der Antigen-Antikörper-Reaktion basiert. Obwohl auf dem Gebiet der IEM-Markierung viele Techniken entwickelt wurden, einschließlich der Präeinbettung von IEM und der Post-Embedding-IEM (auf Harzschnitten oder hydratisierten Kryosektionen), leidet sie immer noch unter einer geringen Markierungseffizienz (<10%)4,5, was mit der Probenvorbereitung und der Antikörperqualität zusammenhängt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, birgt die Entwicklung genetisch kodierter Tags ein großes Anwendungspotenzial.
Zwei Haupttypen von EM-Tags wurden in den letzten Jahren gründlich erforscht. Eine Art ist die DAB-Färbemethode, bei der Tags wie APEX2 verwendet werden, um 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) zu osmiophilen Polymeren für die EM-Visualisierungzu oxidieren 6,7,8,9,10,11,12. Es ermöglicht die Markierung von Proteinen mit hoher Abundanz in subzellulären Regionen, ist aber nicht für die Einzelmolekülzählung geeignet. Der andere Typ nutzt metallbindende Proteine wie Ferritin 13 und Metallothionein (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, um elektronendichte Metallablagerungen in situ für die EM-Visualisierung. Nur Letzteres hat ein echtes Potenzial für die Visualisierung und Zählung einzelner Moleküle. Die Molekülgröße von Ferritin ist zu groß (~450 kD), um als vielversprechender Marker verwendet zu werden, während die geringe Größe (~5 kD) von MT und seine Fähigkeit, verschiedene Ionen durch seine 20 Cystone zu binden, große Aufmerksamkeit erregt haben. Mehrere Labore haben versucht, gereinigte MT-Fusionsproteine oder MT-exprimierende Zellen zu markieren, indem sie direkt mit Au+ inkubiert wurden. Diese Versuche haben zunächst bewiesen, dass MT-Tags Goldionen binden können, um kontrastreiche Signale zu bilden, aber keiner hat wirklich die effektive Identifizierung einzelner Proteine in Zellen erreicht, und sie sind nicht breit anwendbar 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Die ANSM-basierte AuNP-Synthesetechnik, bei der 2-6 nm große AuNPs direkt auf Cystein-reichen Tags (z. B. MT, die MT-Varianten MTn und MTα, AFP) als elektronendichte Markierungen für die EM-Visualisierung synthetisiert werden, ist der erste zuverlässige und anwendbare Ansatz für die Proteinmarkierung und den Einzelmolekülnachweis in Zellen24,25,26. Es ermöglicht die spezifische Synthese von AuNPs auf isolierten Tag-Fusionsproteinen und hat eine beispiellose Markierungseffizienz in nicht fixierten oder chemisch fixierten prokaryotischen (E. coli) und eukaryotischen (S. pombe) Zellen erreicht. Die Implementierung desselben Protokolls in fortschrittlicheren Systemen wie Säugetierzellen oder sogar Geweben bringt jedoch zusätzliche Herausforderungen mit sich, wie z. B. die komplexere intrazelluläre Redoxhomöostase und die fragilere Zellstruktur.
In dieser Arbeit wird eine klonierbare EM-Markierungstechnologie vorgestellt, die die neuartige ANSM-basierte AuNP-Synthesetechnik zur Markierung genetisch kodierter Cystein-reicher Tags (MT) mit der HPF/FSF-Rehydratation-HPF/FSF-Probenvorbereitungsmethode kombiniert und die eindeutige Einzelmolekülidentifizierung von markierten Proteinen in der ER-Membran, im ER-Lumen und in der mitochondrialen Matrix in HeLa-Zellen ermöglicht. Die aktuelle Methode vereint die Eigenschaften einer hohen Markierungseffizienz, eines hohen Signal-Rausch-Verhältnisses, einer Einzelmolekülmarkierung und einer starken Universalität und hat breite Anwendungsperspektiven in der Life-Science-Forschung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Studie stellt hier eine robuste klonierbare EM-Markierungstechnologie für die Einzelmolekül-Visualisierung von Proteinmolekülen in der zellulären Umgebung mit ultrastruktureller Auflösung vor. Die direkt synthetisierten AuNPs auf genetisch kodierten Cystein-reichen Tags ermöglichen eine eindeutige und präzise Lokalisierung der Zielproteine. Hochdruckgefrieren und Gefriersubstitutionstechnik erhalten die Ultrastruktur biologischer Proben hervorragend. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das hier beschriebene Protokoll wurde aus dem Artikel von Jiang et al. (2020) abgeleitet. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des MOST (973 Programme Nr. 2011CB812502 und 2014CB849902) und durch finanzielle Unterstützung der Stadtregierung von Peking unterstützt.
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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