Настоящий протокол описывает технологию маркировки клонируемой электронной микроскопией для обнаружения белков, меченных металлотионеином, в клетках с использованием нового метода синтеза наночастиц золота, основанного на механизме подавления аутонуклеации.
Анализ точной локализации белковых молекул в клетках с ультраструктурным разрешением имеет большое значение для изучения различных физиологических или патологических процессов во всех живых организмах. Таким образом, разработка клонируемых меток, которые можно использовать в качестве зондов электронной микроскопии, имеет большое значение, так же как флуоресцентные белки сыграли решающую роль в области оптической визуализации. Недавно был обнаружен механизм подавления аутонуклеации (ANSM), который позволяет осуществлять специфический синтез наночастиц золота (AuNP) на богатых цистеином метках, таких как металлотионеин (МТ) и антифризный белок (АФП).
На основе ANSM была разработана технология электронной микроскопии маркировки, которая позволяет специфически обнаруживать меченые белки в прокариотических и эукариотических клетках с беспрецедентной эффективностью мечения. Это исследование иллюстрирует протокол обнаружения слитых белков MTn (модифицированный вариант MT, в котором отсутствуют альдегид-реакционноспособные остатки) в клетках млекопитающих с хорошо сохранившейся ультраструктурой. В этом протоколе замораживание под высоким давлением и фиксация замораживанием выполнялись с использованием неальдегидных фиксаторов (таких как дубильная кислота, уранилацетат) для сохранения почти нативной ультраструктуры и предотвращения повреждения активности метки, вызванного альдегидным сшиванием.
Простая одностадийная регидратация использовалась до синтеза AuNP на основе ANSM. Результаты показали, что меченые белки нацелены на различные органеллы, включая мембраны и просвет эндоплазматического ретикулума (ER), а митохондриальные матрицы были обнаружены с высокой эффективностью и специфичностью. Это исследование предоставляет биологам надежный протокол для решения огромного круга биологических вопросов на уровне одной молекулы в клеточном ультраструктурном контексте.
В постгеномную эпоху разработка зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве одномолекулярного репортера для световой микроскопии произвела революцию в области современных исследований в области наук о жизни 1,2. На протяжении десятилетий электронная микроскопия (ЭМ) была мощным инструментом для интуитивного наблюдения за клеточной ультраструктурой с наноразмерным разрешением3; Однако точная идентификация и локализация белковых молекул остаются сложной задачей.
Наиболее часто используемым методом ЭМ-мечения является метод маркировки иммуноэлектронной микроскопии (IEM), который основан на реакции антиген-антитело. Однако, несмотря на то, что в области маркировки ИЭМ было разработано множество методов, включая предварительную и поствстраиваемую ИЭМ (на срезах смолы или гидратированных криосекциях), она по-прежнему страдает от низкой эффективности маркировки (<10%)4,5, что связано с подготовкой образцов и качеством антител. Чтобы преодолеть эти ограничения, разработка генетически закодированных меток имеет большой потенциал применения.
В последние годы были тщательно изучены два основных типа электромагнитных меток. Одним из типов является метод окрашивания DAB, в котором используются такие метки, как APEX2, для окисления 3,3′-диаминобензидина (DAB) до осмофильных полимеров для ЭМ-визуализации 6,7,8,9,10,11,12. Он позволяет маркировать белки с высоким содержанием в субклеточных областях, но не подходит для подсчета отдельных молекул. Другой тип использует металлсвязывающие белки, такие как ферритин 13 и металлотионеин (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, для образования электронно-плотных металлических отложений в situ для ЭМ-визуализации. Только последний обладает реальным потенциалом для визуализации и подсчета одномолекул. Молекулярный размер ферритина слишком велик (~ 450 кДа), чтобы его можно было использовать в качестве перспективной метки, в то время как маленький размер (~ 5 кДа) МТ и его способность связывать различные ионы через свои 20 цистеинов привлекли большое внимание. Несколько лабораторий пытались маркировать очищенные белки слияния МТ или клетки, экспрессирующие МТ, путем инкубации непосредственно с Au +. Эти попытки первоначально доказали, что метки МТ могут связывать ионы золота с образованием высококонтрастных сигналов, но ни одна из них не достигла эффективной идентификации отдельных белков в клетках, и они не являются широко применимыми 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Метод синтеза AuNP на основе ANSM, который включает синтез AuNP размером 2-6 нм непосредственно на метках, богатых цистеином (например, MT, варианты MT MTn и MTα, AFP) в качестве электронно-плотных меток для ЭМ-визуализации, является первым надежным и применимым подходом к маркировке белков и обнаружению отдельных молекул в клетках24,25,26. Он позволяет осуществлять специфический синтез AuNP на изолированных белках слияния меток и достиг беспрецедентной эффективности маркировки в нефиксированных или химически фиксированных прокариотических (E. coli) и эукариотических (S. pombe) клетках. Однако реализация того же протокола в более продвинутых системах, таких как клетки млекопитающих или даже ткани, сопряжена с дополнительными проблемами, такими как более сложный внутриклеточный окислительно-восстановительный гомеостаз и более хрупкая клеточная структура.
В этом исследовании представлена клонируемая технология ЭМ-мечения, которая сочетает в себе новый метод синтеза AuNP на основе ANSM для маркировки генетически кодируемых цистеин-богатых меток (MT) с методом пробоподготовки HPF/FSF-регидратации-HPF/FSF, что позволяет однозначно идентифицировать меченые белки по одной молекуле в мембране ER, просвете ER и митохондриальном матриксе в клетках HeLa. Современный метод сочетает в себе такие характеристики, как высокая эффективность мечения, высокое отношение сигнал/шум, одномолекулярная маркировка и сильная универсальность, и этот метод имеет широкие перспективы применения в исследованиях в области наук о жизни.
В исследовании представлена надежная клонируемая технология электромагнитной маркировки для визуализации одномолекулярных белковых молекул в клеточной среде с ультраструктурным разрешением. AuNP, непосредственно синтезированные на генетически кодируемых метках, богатых цистеином, …
The authors have nothing to disclose.
Описанный здесь протокол был взят из статьи, опубликованной Jiang et al. (2020). Эта работа была поддержана грантами MOST (973 программы No 2011CB812502 и 2014CB849902) и финансовой поддержкой муниципального правительства Пекина.
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
D-penicillamine | TCI | P0147 | |
Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
Foam cryobox | |||
Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
HEPES | sigma | H3375-500G | |
HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
Tweezers | Dumont | ||
Ultramictotome | Leica | FC7 | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |