Direkt syntes av EM-synliga guldnanopartiklar i celler för proteinlokaliseringsanalys med välbevarad ultrastruktur
Summary
Det nuvarande protokollet beskriver en klonbar elektronmikroskopimärkningsteknik för detektering av metallotioneintaggade proteiner i celler med hjälp av en ny autonukleationssuppressionsmekanismbaserad guldnanopartikelsyntesteknik.
Abstract
Att analysera den exakta lokaliseringen av proteinmolekyler i celler med ultrastrukturell upplösning är av stor betydelse för studier av olika fysiologiska eller patologiska processer i alla levande organismer. Därför är utvecklingen av klonbara taggar som kan användas som elektronmikroskopiprober av stort värde, precis som fluorescerande proteiner har spelat en avgörande roll inom optisk avbildning. Autonucleation suppression mechanism (ANSM) upptäcktes nyligen, vilket möjliggör specifik syntes av guldnanopartiklar (AuNP) på cysteinrika taggar, såsom metallotionein (MT) och frostskyddsprotein (AFP).
Baserat på ANSM utvecklades en elektronmikroskopimärkningsteknik som möjliggör specifik detektion av märkta proteiner i prokaryota och eukaryota celler med en oöverträffad märkningseffektivitet. Denna studie illustrerar ett protokoll för detektion av MTn (en konstruerad MT-variant som saknar aldehydreaktiva rester) fusionsproteiner i däggdjursceller med välbevarad ultrastruktur. I detta protokoll utfördes högtrycksfrysning och fryssubstitutionsfixering med användning av icke-aldehydfixeringsmedel (såsom garvsyra, uranylacetat) för att bevara nästan naturlig ultrastruktur och undvika skador på taggaktiviteten orsakad av aldehydtvärbindning.
En enkel enstegs rehydrering användes före den ANSM-baserade AuNP-syntesen. Resultaten visade att de märkta proteinerna riktade sig mot olika organeller, inklusive membranen och lumen i endoplasmatisk retikulum (ER), och mitokondriella matriser detekterades med hög effektivitet och specificitet. Denna forskning ger biologer ett robust protokoll för att ta itu med ett enormt antal biologiska frågor på enmolekylnivå i cellulära ultrastrukturella sammanhang.
Introduction
I den postgenomiska eran har utvecklingen av grönt fluorescerande protein (GFP) som en enmolekylär reporter för ljusmikroskopi revolutionerat området för modern life science-forskning 1,2. I årtionden har elektronmikroskopi (EM) varit ett kraftfullt verktyg för att intuitivt observera den cellulära ultrastrukturen med nanoskala upplösning3; Den exakta identifieringen och lokaliseringen av proteinmolekyler är dock fortfarande utmanande.
Den vanligaste EM-märkningstekniken är immunelektronmikroskopi (IEM) märkningsteknik, som är baserad på antigen-antikroppsreaktionen. Även om många tekniker har utvecklats inom IEM-märkning, inklusive förinbäddning av IEM och efterinbäddning av IEM (på hartssektioner eller hydratiserade kryosektioner), lider den fortfarande av låg märkningseffektivitet (<10%)4,5, vilket är relaterat till provberedningen och antikroppskvaliteten. För att övervinna dessa begränsningar har utveckling av genetiskt kodade taggar stor applikationspotential.
Två huvudtyper av EM-taggar har utforskats grundligt de senaste åren. En typ är DAB-färgningsmetoden, som använder taggar som APEX2 för att oxidera 3,3′-diaminobensidin (DAB) till osmiofila polymerer för EM-visualisering 6,7,8,9,10,11,12. Det möjliggör märkning av proteiner med hög förekomst i subcellulära regioner men är inte lämpligt för räkning av enstaka molekyler. Den andra typen använder metallbindande proteiner, såsom ferritin 13 och metallotionein (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, för att generera elektrontäta metallavlagringar i situ för EM-visualisering. Endast den senare har verklig potential för visualisering och räkning av en molekyl. Ferritins molekylstorlek är för stor (~450 kD) för att den ska kunna användas som en lovande tagg, medan den lilla storleken (~5 kD) på MT och dess förmåga att binda olika joner genom sina 20 cystein har väckt stor uppmärksamhet. Flera laboratorier har försökt märka renade MT-fusionsproteiner eller MT-uttryckande celler genom att inkubera direkt med Au+. Dessa försök har initialt visat att MT-taggar kan binda guldjoner för att bilda högkontrastsignaler, men ingen har verkligen uppnått effektiv identifiering av enskilda proteiner i celler, och de är inte allmänt tillämpliga 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Den ANSM-baserade AuNP-syntestekniken, som innebär att man syntetiserar 2-6 nm-stora AuNPs direkt på cysteinrika taggar (t.ex. MT, MT-varianterna MTn och MTα, AFP) som elektrontäta etiketter för EM-visualisering, är det första pålitliga och tillämpliga tillvägagångssättet för proteinmärkning och detektering av enstaka molekyler i celler24,25,26. Det möjliggör specifik syntes av AuNPs på isolerade taggfusionsproteiner och har uppnått en oöverträffad märkningseffektivitet i icke-fixerade eller kemiskt fixerade prokaryota (E. coli) och eukaryota (S. pombe) celler. Att implementera samma protokoll i mer avancerade system som däggdjursceller eller till och med vävnader innebär emellertid ytterligare utmaningar, såsom den mer komplexa intracellulära redoxhomeostasen och mer ömtålig cellulär struktur.
Denna studie presenterar en klonbar EM-märkningsteknik, som kombinerar den nya ANSM-baserade AuNP-syntestekniken för märkning av genetiskt kodade cysteinrika taggar (MT) med HPF / FSF-rehydrering-HPF / FSF-provberedningsmetoden, möjliggör entydig enmolekylidentifiering av märkta proteiner i ER-membranet, ER-lumen och mitokondriell matris i HeLa-celler. Den nuvarande metoden kombinerar egenskaperna hög märkningseffektivitet, ett högt signal-brusförhållande, enmolekylmärkning och stark universalitet, och denna metod har breda tillämpningsmöjligheter inom life science-forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien presenterar här en robust klonbar EM-märkningsteknik för enmolekylvisualisering av proteinmolekyler i cellmiljön med ultrastrukturell upplösning. AuNPs direkt syntetiserade på genetiskt kodade cysteinrika taggar ger entydig och exakt lokalisering av målproteinerna. Högtrycksfrysning och fryssubstitutionsteknik bevarar utmärkt ultrastrukturen hos biologiska prover. Sammantaget ger den klonbara elektronmikroskopimärkningstekniken som presenteras här ett kraftfullt verktyg för effektiv lokalisering och i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Protokollet som beskrivs här härleddes från artikeln publicerad av Jiang et al. (2020). Detta arbete stöddes av bidrag från MOST (973 Program nr 2011CB812502 och 2014CB849902) och genom finansieringsstöd från Pekings kommunregering.
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -. W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
