İyi Korunmuş Ultrayapı ile Protein Lokalizasyon Analizi için Hücrelerde EM-Görünür Altın Nanopartiküllerinin Doğrudan Sentezi
Summary
Mevcut protokol, yeni bir otonükleasyon bastırma mekanizmasına dayalı altın nanopartikül sentez tekniği kullanarak hücrelerdeki metallothionein etiketli proteinleri tespit etmek için klonlanabilir bir elektron mikroskobu etiketleme teknolojisini tanımlamaktadır.
Abstract
Protein moleküllerinin ultrayapısal çözünürlüğe sahip hücrelerdeki hassas lokalizasyonunun analiz edilmesi, tüm canlı organizmalarda çeşitli fizyolojik veya patolojik süreçlerin incelenmesi için büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle, elektron mikroskobu probları olarak kullanılabilecek klonlanabilir etiketlerin geliştirilmesi, floresan proteinlerin optik görüntüleme alanında çok önemli bir rol oynadığı gibi, büyük bir değere sahiptir. Otonükleasyon bastırma mekanizması (ANSM) yakın zamanda ortaya çıkarıldı, bu da metallothionein (MT) ve antifriz proteini (AFP) gibi sistein bakımından zengin etiketler üzerinde altın nanopartiküllerinin (AuNP’ler) spesifik sentezine izin veriyor.
ANSM’ye dayanarak, prokaryotik ve ökaryotik hücrelerdeki etiketlenmiş proteinlerin benzeri görülmemiş bir etiketleme verimliliği ile spesifik olarak algılanmasını sağlayan bir elektron mikroskobu etiketleme teknolojisi geliştirilmiştir. Bu çalışma, iyi korunmuş ultra yapıya sahip memeli hücrelerinde MTn (aldehit-reaktif kalıntıları olmayan mühendislik ürünü bir MT varyantı) füzyon proteinlerinin tespiti için bir protokol göstermektedir. Bu protokolde, yüksek basınçlı dondurma ve dondurarak ikame fiksasyonu, aldehit olmayan fiksatifler (tanik asit, uranil asetat gibi) kullanılarak, doğal ultrayapıyı korumak ve aldehit çapraz bağlanmasının neden olduğu etiket aktivitesinin zarar görmesini önlemek için gerçekleştirilmiştir.
ANSM tabanlı AuNP sentezinden önce basit bir tek adımlı rehidrasyon kullanılmıştır. Sonuçlar, etiketlenmiş proteinlerin endoplazmik retikulumun (ER) zarları ve lümeni de dahil olmak üzere çeşitli organelleri hedeflediğini ve mitokondriyal matrislerin yüksek verimlilik ve özgüllükle tespit edildiğini gösterdi. Bu araştırma, biyologlara hücresel ultrayapısal bağlamlarda tek molekül düzeyinde çok çeşitli biyolojik soruları ele almak için sağlam bir protokol sunmaktadır.
Introduction
Postgenomik çağda, ışık mikroskobu için tek moleküllü bir muhabir olarak yeşil floresan proteinin (GFP) geliştirilmesi, modern yaşam bilimleri araştırma alanında devrim yaratmıştır 1,2. Onlarca yıldır, elektron mikroskobu (EM), nano ölçekli çözünürlük3 ile hücresel ultrayapıyı sezgisel olarak gözlemlemek için güçlü bir araç olmuştur; Bununla birlikte, protein moleküllerinin kesin olarak tanımlanması ve lokalizasyonu zor olmaya devam etmektedir.
En sık kullanılan EM etiketleme tekniği, antijen-antikor reaksiyonuna dayanan immünoelektron mikroskopi (IEM) etiketleme tekniğidir. Bununla birlikte, IEM etiketleme alanında, IEM gömme öncesi ve gömme sonrası IEM (reçine kesitleri veya hidratlı kriyokesitler üzerinde) dahil olmak üzere birçok teknik geliştirilmiş olmasına rağmen, numune hazırlama ve antikor kalitesi ile ilgili düşük etiketleme verimliliğinden (% <10) 4,5 muzdariptir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, genetik olarak kodlanmış etiketler geliştirmek büyük bir uygulama potansiyeline sahiptir.
Son yıllarda iki ana EM etiketi türü kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır. Bir tip, EM görselleştirme 6,7,8,9,10,11,12 için 3,3‘-diaminobenzidine (DAB) ozmiofilik polimerlere oksitlemek için APEX2 gibi etiketleri kullanan DAB boyama yöntemidir. Hücre altı bölgelerde yüksek bolluktaki proteinlerin etiketlenmesini sağlar, ancak tek moleküllü sayım için uygun değildir. Diğer tip, ferritin 13 ve metallothionein (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 gibi metal bağlayıcı proteinleri kullanır. EM görselleştirme için situ. Sadece ikincisi tek moleküllü görselleştirme ve sayma için gerçek potansiyele sahiptir. Ferritinin moleküler boyutu, umut verici bir etiket olarak kullanılamayacak kadar büyüktür (~ 450 kD), MT’nin küçük boyutu (~ 5 kD) ve 20 sistein yoluyla çeşitli iyonları bağlama kabiliyeti büyük ilgi görmüştür. Birkaç laboratuvar, saflaştırılmış MT-füzyon proteinlerini veya MT eksprese eden hücreleri doğrudan Au + ile inkübe ederek etiketlemeye çalışmıştır. Bu girişimler başlangıçta MT etiketlerinin altın iyonlarını yüksek kontrastlı sinyaller oluşturmak için bağlayabildiğini kanıtladı, ancak hiçbiri hücrelerdeki bireysel proteinlerin etkili bir şekilde tanımlanmasını gerçekten başaramadı ve yaygın olarak uygulanamıyor 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
EM görselleştirme için elektron yoğun etiketler olarak 2-6 nm boyutlu AuNP’lerin doğrudan sistein bakımından zengin etiketler (örneğin, MT, MT varyantları MTn ve MTa, AFP) üzerinde sentezlenmesini içeren ANSM tabanlı AuNP sentez tekniği,24,25,26 hücrelerinde protein etiketleme ve tek molekül tespiti için ilk güvenilir ve uygulanabilir yaklaşımdır. İzole etiket füzyon proteinleri üzerinde AuNP’lerin spesifik sentezine izin verir ve sabit olmayan veya kimyasal olarak sabitlenmiş prokaryotik (E. coli) ve ökaryotik (S. pombe) hücrelerde benzeri görülmemiş bir etiketleme verimliliği elde etmiştir. Bununla birlikte, aynı protokolün memeli hücreleri ve hatta dokular gibi daha gelişmiş sistemlerde uygulanması, daha karmaşık hücre içi redoks homeostazı ve daha kırılgan hücresel yapı gibi ek zorluklar içerir.
Bu çalışma, genetik olarak kodlanmış sistein bakımından zengin etiketleri (MT) etiketlemek için yeni ANSM tabanlı AuNP sentez tekniğini HPF / FSF-rehidrasyon-HPF / FSF numune hazırlama yöntemiyle birleştiren klonlanabilir bir EM etiketleme teknolojisi sunarak, HeLa hücrelerinde ER membranı, ER lümeni ve mitokondriyal matristeki etiketlenmiş proteinlerin açık bir şekilde tek moleküllü tanımlanmasını sağlar. Mevcut yöntem, yüksek etiketleme verimliliği, yüksek sinyal-gürültü oranı, tek moleküllü etiketleme ve güçlü evrensellik özelliklerini birleştirir ve bu yöntemin yaşam bilimleri araştırmalarında geniş uygulama beklentileri vardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çalışma burada, hücresel ortamdaki protein moleküllerinin ultrayapısal çözünürlükle tek moleküllü görselleştirilmesi için sağlam bir klonlanabilir EM etiketleme teknolojisi sunmaktadır. Doğrudan genetik olarak kodlanmış sistein bakımından zengin etiketler üzerinde sentezlenen AuNP’ler, hedef proteinlerin açık ve kesin lokalizasyonunu sağlar. Yüksek basınçlı dondurma ve dondurarak ikame tekniği, biyolojik numunelerin ultra yapısını mükemmel bir şekilde korur. Birlikte ele alındığın…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Burada açıklanan protokol, Jiang et al. (2020) tarafından yayınlanan makaleden türetilmiştir. Bu çalışma, MOST’tan (973 Program no. 2011CB812502 ve 2014CB849902) gelen hibeler ve Pekin Belediye Hükümeti’nin finansman desteği ile desteklenmiştir.
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -. W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
