Vi præsenterer en totrinsprotokol til mitokondrieisolering af høj kvalitet, der er kompatibel med proteinopdagelse og kvantificering på proteomskala. Vores protokol kræver ikke genteknologi og er derfor velegnet til at studere mitokondrier fra alle primære celler og væv.
De fleste fysiologiske og sygdomsprocesser, fra central metabolisme til immunrespons til neurodegeneration, involverer mitokondrier. Mitokondrieproteomet består af mere end 1.000 proteiner, og overflod af hver kan variere dynamisk som reaktion på eksterne stimuli eller under sygdomsprogression. Her beskriver vi en protokol til isolering af mitokondrier af høj kvalitet fra primære celler og væv. Totrinsproceduren omfatter (1) mekanisk homogenisering og differentiel centrifugering for at isolere rå mitokondrier og (2) tagfri immunindfangning af mitokondrier for at isolere rene organeller og eliminere forurenende stoffer. Mitokondrieproteiner fra hvert oprensningstrin analyseres ved kvantitativ massespektrometri, og berigelsesudbytter beregnes, hvilket muliggør opdagelsen af nye mitokondrieproteiner ved subtraktiv proteomik. Vores protokol giver en følsom og omfattende tilgang til at studere mitokondrieindhold i cellelinjer, primære celler og væv.
Mitokondrier er komplekse og dynamiske organeller, der er i stand til at mærke og tilpasse sig cellens metaboliske behov. Mitokondrier er centrale for kompleksiteten af cellulær metabolisme og fungerer som metaboliske knudepunkter, hvor kulhydrat-, protein-, lipid-, nukleinsyre- og co-faktormetabolismereaktioner konvergerer1. De tjener også som signalorganeller for veje for det medfødte immunrespons og som reaktion på ændringer i ioner og reaktive iltarter 2,3. Til dato er omkring 1.100 proteiner blevet kortlagt til mitokondrier 4,5,6, men vi kan antage, at mange flere stadig skal opdages, især dem, der kun udtrykkes i visse celletyper eller forbigående under specifikke miljøforhold. Udvikling af nye tilgange til kvantificering af ændringer i mitokondriesammensætning i metaboliske tilstande af interesse vil øge vores viden om disse organeller og fremhæve nye terapeutiske veje til de lidelser, der er karakteriseret ved mitokondriel dysfunktion7.
I øjeblikket er forskellige mitokondrieisoleringsprotokoller tilgængelige med forskellige udbytter og renhedsniveauer8. Centrifugeringsbaserede tilgange er de mest populære på grund af deres enkelhed og lave omkostninger. Selvom differentiel centrifugering er egnet til de fleste applikationer, har den den ulempe, at den opnår lavere mitokondriel renhed og kræver store mængder udgangsmateriale, når der anvendes mere komplekse densitetsgradientbaserede applikationer. I de senere år er der opstået nye metoder til mitokondrieisolering, såsom tagbaseret immunindfangning (“MITO-IP”)9 og fluorescensaktiveret organelsortering10. Selvom begge procedurer kan generere prøver med høj renhed, kræver førstnævnte genteknologi til at mærke mitokondrier til affinitetsrensning, hvilket gør protokollerne uforenelige med primært materiale fra umodificerede organismer eller menneskelige donorer. I mellemtiden er sidstnævnte afhængig af adgang til flowcytometri og sorteringsinstrumenter. Kombination af forskellige isoleringsmetoder giver løftet om at generere mere robuste protokoller og øget renhed.
Her præsenterer vi en ny protokol for mitokondrieisolering baseret på kombinationen af to eksisterende metoder: (1) differentiel centrifugering for at isolere en rå mitokondriefraktion og (2) tagfri immunoptagelse af mitokondrier med superparamagnetiske perler kovalent bundet til antistoffer mod translocase af ydre mitokondriemembran 22 (Tomm22)11, et allestedsnærværende mitokondrielt ydre membranprotein (figur 1). Den procedure, vi beskriver, er kompatibel med kvantitativ proteinmassespektrometri, og fordi den er tagfri og ikke kræver genetisk manipulation, kan den anvendes på en bred vifte af forskningsmodeller, fra cellelinjer til kropsvæsker til hele dyrevæv. Desuden muliggør brugen af to trin i protokollen brugen af subtraktiv proteomics 6,12 til opdagelse af nye mitokondrieproteiner og undersøgelse af deres ekspression.
Vi har kombineret differentiel centrifugering og immunindfangning for at opnå en forbedret renhed for mitokondrieisolering. Vores procedure giver adgang til primært materiale til identifikation og karakterisering af nye mitokondrieproteiner. Protokollen er ligetil og robust og kan anvendes på cellelinjer, primære celler og væv uden behov for genetisk modifikation. Vi har valideret vores protokol ved immunoblotting og proteomics analyser på prøver taget på forskellige stadier i løbet af rensningsproceduren.
Sammenlignet med enkeltisoleringsmetoder genererer kombinationen af berigelsestrin af forskellig art – her centrifugering og immunmærkning – en mere robust protokol til isolering af mitokondrier. Dette skyldes, at mens mitokondrieproteiner vil blive beriget i begge rensninger, er det usandsynligt, at forurenende stoffer også vil blive beriget efter begge berigelsestrin. Selvom høj mitokondriel renhed også kan opnås ved densitetsgradient ultracentrifugering, kræver denne tilgang en stor mængde udgangsmateriale og adgang til en ultracentrifuge. Endelig kræver vores tilgang i modsætning til nyere metoder baseret på tagbaseret mitokondrieisolering20 ikke genetisk modifikation af prøven, hvilket gør den velegnet til primært materiale fra enhver kilde.
Nogle tekniske og biologiske overvejelser skal tages i betragtning i det eksperimentelle design, når vi anvender vores protokol. (1) Mængden af udgangsmateriale er kritisk for at opnå tilstrækkeligt materiale. Uundgåeligt vil et lille antal mitokondrier gå tabt under homogenisering (trin 3.10), da ikke alle celler lyseres eller under de tre søjlevasker (trin 4.6). Mens vores protokol fokuserer på renhed frem for udbytte, er effektiviteten af mitokondrieisolering og dermed deres udbytte ikke blevet målt eller optimeret. Brug af flere Tomm22-perler og flere søjler forventes at øge udbyttet af mitokondriegendannelse. Samtidig kan en grundig optimering af homogeniseringstrinnet også føre til forbedret mitokondrieudbytte. Denne protokol og de indledende cellenumre, vi rapporterer her for RAW264.7-celler og BMDM’er, er tilstrækkelige til proteomics og kan justeres til andre applikationer. I tilfælde af primære BMDM’er fandt vi, at en enkelt mus var tilstrækkelig til en replikat. Når det er nødvendigt, kan proceduren skaleres op for at isolere BMDM’er fra flere dyr, som derefter kan samles for at opnå tilstrækkeligt materiale. Cellenummeret kan optimeres afhængigt af celletypen, dens størrelse og dens mitokondrieindhold. (2) Tomm22 udtrykkes på mitokondrier fra alle celletyper og væv21, men udtryksniveauet kan variere. Når man designer et eksperiment til sammenligning af forskellige forhold, er det derfor vigtigt at sikre, at ekspressionsniveauerne for Tomm22 er sammenlignelige. På grund af den allestedsnærværende ekspression af Tomm22 er det desuden ikke muligt at studere celletypespecifikke mitokondrieproteiner i komplekse væv. (3) Den tid, det tager at generere rene mitokondrier (ca. 2,5 timer), er uforenelig med en undersøgelse af forbigående hændelser, såsom ændringer i metaboliske profiler. I dette tilfælde anbefaler vi direkte tagbaseret immunindfangning9, som også gør det muligt at studere celletypespecifikke mitokondrier in vivo20. (4) Selvom undersøgelser af isolerede mitokondrier opnået ved hjælp af Tomm22-antistofmærkede perler alene har vist aktivitet i funktionelle assays11, er det endnu ikke fastslået, om mitokondrier, der genereres med vores protokol, er kompatible med downstream-aktivitetsbaserede assays. MitoTracker eller tetramethylrhodamin methylester perchlorat (TMRM) farvning eller respirometri målinger er potentielle tilgange til kvantificering af funktionaliteten af isolerede mitokondrier22. (5) Efter eluering af den “mitorene” prøve fra kolonnen vil nogle Tomm22-perler være til stede i den rene mitokondriefraktion (Figur 2B). Selvom vi ikke har observeret nogen interferens med trypsinfordøjelsen og proteinmassespektrometrien, bør tilstedeværelsen af disse perler og immunglobulinerne tages i betragtning i andre downstream-applikationer. Tomm22-antistoffet er et monoklonalt antistof produceret i mus23, og derfor er det vigtigt at huske på, at når der anvendes sekundære antistoffer mod mus i immunoblotting, vil det generere uspecifikke bånd på størrelse med immunglobulinkæderne. (6) Fuldstændig homogenisering af cellesuspensionen er nøglen til en vellykket isolering af mitokondrier. Her bruger vi en sprøjte med en 25 G nål til at lyse både RAW264.7 celler og BMDM’er. Afhængigt af celletypen og dens størrelse kan andre mekaniske homogeniseringsmetoder, såsom anvendelse af en Dounce-homogenisator eller mere kontrollerede tilgange som cellehomogeniseringsenheder, imidlertid være mere egnede. Ikke-mekaniske homogeniseringsmetoder, såsom blid sonikering, kan også overvejes. Vævshomogeniseringsmetoder diskuteres yderligere i andre undersøgelser24,25. (7) Selv om validering ved hjælp af immunblotting er den mest enkle og billigere metode, korrelerer resultaterne heraf ikke altid med ændringer på hele organelniveau. Derfor anbefaler vi at bruge proteomics til fuldt ud at validere berigelsen eller udtømningen af henholdsvis mitokondrier og andre organeller.
To-trins mitokondrierensningsprotokollen, der er beskrevet her, har gjort det muligt for os at generere sekventielle prøver med stigende mitokondriel renhed, og dette har gjort det muligt for os at opdage nye mitokondrieproteinkandidater gennem subtraktiv proteomics12. Til vores analyse bruger vi strenge tærskler til at selektere for signifikant berigede mitokondrieproteiner, og selvom dette muligvis ikke identificerer nogle kendte mitokondrieproteiner (figur 3A), reduceres den falsk-positive rate for opdagelse af nyt mitokondrieprotein. Ikke desto mindre er det vigtigt at understrege, at alle kandidatproteiner, der afsløres af vores protokol, skal valideres gennem ortogonale tilgange. Vi anbefaler carboxy-terminal GFP-mærkning eller brug af antistoffer mod det endogene protein for at validere association med mitokondrier enten mikroskopisk eller ved proteasebeskyttelsesassays.
Den direkte anvendelse af vores metode i tilfælde af umodificerede celler og væv tilbyder et kraftfuldt værktøj til at undersøge, hvordan mitokondrier ændrer sig og tilpasser sig deres miljø under sunde og sygdomsforhold. Anvendelse af vores protokol til cellelinjer, dyresygdomsmodeller, humane væsker og endda biopsier fra kirurgi kan vise sig at være særligt nyttige til at forbedre vores forståelse af mitokondrier og deres tilknyttede lidelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Manfredo Quadroni, proteinanalysefaciliteten og elektronmikroskopifaciliteten ved universitetet i Lausanne for deres hjælp. Vi takker også H.G. Sprenger, K. Maundrell og medlemmer af Jourdain-laboratoriet for råd og feedback på manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Foundation Pierre-Mercier pour la Science og Swiss National Science Foundation (projektbevilling 310030_200796).
1 mL syringe | BD Plastipal | 309628 | |
25 G Needle | BD Microlance | 300400 | |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
Anti-TOM22 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-127-693 | |
Cell scraper | FisherScientific | 11577692 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | ThermoFisher | 31966 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | FisherScientific | BP-120-1 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | |
HEPES | BioConcept | 5-31F00-H | |
LS columns and plungers | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Macrophage colony-stimulating factor | Immunotools | 12343115 | |
Mannitol | Sigma | M4125 | |
Sodium chloride | Sigma | 71380 | |
Sucrose | Sigma | S1888 | |
Penicillin/Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
Petri dishes | Corning | BH93B-102 | |
Phosphate-buffered saline 10X | Eurobio Scientific | CS3PBS01-01 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | C19196 |