Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação

Summary

A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.

Abstract

O potencial endococlear, gerado pela estria vascular, é essencial para manter um ambiente propício à adequada mecanotransdução das células ciliadas e, finalmente, à audição. Patologias da estria vascular podem resultar em diminuição da audição. A dissecção da estria vascular do adulto permite a captura focalizada de núcleo único e subsequente sequenciamento e imunomarcação de núcleo único. Essas técnicas são usadas para estudar a fisiopatologia da estria vascular em nível unicelular.

O sequenciamento de núcleo único pode ser usado na análise transcricional da estria vascular. Enquanto isso, a imunomarcação continua a ser útil na identificação de populações específicas de células. Ambos os métodos requerem dissecção adequada da estria vascular como pré-requisito, o que pode revelar-se tecnicamente desafiador.

Introduction

A cóclea consiste de três câmaras cheias de líquido, a escala vestibular, a escala média e a escala timpânica. A escala vestibular e a escala timpânica contêm perilinfa, que apresenta alta concentração de sódio (138 mM) e baixa concentração de potássio (6,8 mM)¹. A escala média contém endolinfa, que apresenta alta concentração de potássio (154 mM) e baixa concentração de sódio (0,91 mM)^1,2,3. Essa diferença na concentração de íons pode ser chamada de potencial endococlear (PE), e é gerada primariamente pelo movimento de íons potássio através de vários canais iônicos e junções comunicantes na estria vascular (VS) ao longo da parede lateral da cóclea4,5,6,7,8,9,10,11 . A VS é um tecido heterogêneo, altamente vascularizado, que reveste a face medial da parede lateral da cóclea e contém três tipos celulares principais: células marginais, intermediárias e^basais12 (Figura 1).

As células marginais são conectadas por tight junctions para formar a superfície mais medial da VS. A membrana apical está voltada para a endolinfa da escala média e contribui para o transporte iônico de potássio para a endolinfa usando vários canais, incluindo KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 e Na+–K⁺-ATPase (NKA)^5,10,13,14. As células intermediárias são células pigmentadas que residem entre as células marginais e basais e facilitam o transporte de potássio através da VS utilizando KCNJ10 (Kir 4.1)^15,16. As células basais estão próximas à parede lateral da cóclea e estão intimamente associadas aos fibrócitos do ligamento espiral para promover a reciclagem de potássio da perilinfa12. A patologia da VS tem sido implicada em inúmeras afecções^{otológicas17,18}. Mutações em genes expressos nos principais tipos celulares de VS, como Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 e Cldn11, podem causar surdez e disfunção de VS, incluindo a perda de PE19,20,21,22,23. Além dos três principais tipos celulares, existem outros tipos celulares menos estudados na VS, como as células fusiformes22, as células radiculares12,24, os macrófagos25, os pericitos26 e as células endoteliais27^, que têm papéis incompletamente definidos envolvendo a homeostase iônica e a geração de ^EP28.

Em comparação com o sequenciamento de RNA em massa, o sequenciamento de RNA de núcleo único (sNuc-Seq) fornece informações sobre a heterogeneidade celular, em vez de uma média de RNAm em um grupo de células²⁹, e pode ser particularmente útil ao estudar o SV³⁰ heterogêneo. Por exemplo, o sNuc-Seq produziu uma análise transcricional que sugere que pode haver um papel das células fusiformes e radiculares na geração de PE, perda auditiva e doença de Ménière¹⁸. Uma caracterização transcricional adicional dos vários tipos de células da VS pode nos fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia subjacente aos diferentes mecanismos e subtipos de flutuação e perda auditiva relacionados à VS. A colheita dessas delicadas estruturas da orelha interna é de suma importância para a análise ótima dos tecidos.

Neste estudo, a abordagem de microdissecção para acessar e isolar a estria vascular da cóclea de camundongos adultos para sNuc-Seq ou imunomarcação é descrita. A dissecção do VS de camundongos adultos é necessária para entender vários tipos de células VS e caracterizar melhor seu papel na audição.

Protocol

Todos os experimentos e procedimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e do National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e pelo National Institute on Deafness and Other Communication Disorders,…

Representative Results

Apresentamos um método para isolar o VS a ser usado para sNuc-Seq ou imunomarcação. A anatomia relevante (Figura 1) da cóclea em relação à VS pode ajudar o usuário a entender melhor a organização da VS e as etapas do protocolo de dissecção. Cada passo dessa microdissecção de VS de um mouse P30 é detalhado no vídeo associado, e instantâneos dos principais passos dessa dissecção e isolamento de VS são apresentados na Figura 2…

Discussion

Antes do advento do sequenciamento de célula única, muitos pesquisadores usaram a análise de tecido em massa, que só tornou possível analisar transcriptomas médios entre células. Em particular, unicelular e sNuc-Seq permitiram isolar o transcriptoma de uma única célula ou núcleo único, respectivamente³². Nesse caso, transcriptomas de núcleo único podem ser identificados para células marginais, intermediárias e basais, bem como células fusiformes³⁰. Isso perm…

Materials

10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections