Den stria vascularis är avgörande för genereringen av endokokleär potential. Här presenterar vi dissektionen av den vuxna musen stria vascularis för sekvensering av en kärna eller immunfärgning.
Endokokleär potential, som genereras av stria vascularis, är avgörande för att upprätthålla en miljö som bidrar till lämplig hårcellsmekanotransduktion och slutligen hörsel. Patologier av stria vascularis kan leda till minskad hörsel. Dissektion av den vuxna stria vascularis möjliggör fokuserad enkärnig infångning och efterföljande sekvensering och immunfärgning med en kärna. Dessa tekniker används för att studera stria vascularis patofysiologi på encellsnivå.
Enkärnig sekvensering kan användas vid inställning av transkriptionsanalys av stria vascularis. Samtidigt fortsätter immunfärgning att vara användbar för att identifiera specifika populationer av celler. Båda metoderna kräver korrekt stria vascularis-dissektion som en förutsättning, vilket kan visa sig vara tekniskt utmanande.
Cochlean består av tre vätskefyllda kamrar, scala vestibuli, scala media och scala tympani. Scala vestibuli och scala tympani innehåller vardera perilymfa, som har en hög koncentration av natrium (138 mM) och en låg koncentration av kalium (6,8 mM)1. Scalamediet innehåller endolymf, som har en hög koncentration av kalium (154 mM) och en låg koncentration av natrium (0,91 mM)1,2,3. Denna skillnad i jonkoncentration kan kallas endokokleär potential (EP), och genereras främst av rörelsen av kaliumjoner genom olika jonkanaler och gapkorsningar i stria vascularis (SV) längs sidoväggen i cochlea 4,5,6,7,8,9,11 . SV är en heterogen, mycket vaskulär vävnad som leder den mediala aspekten av cochleans sidovägg och innehåller tre huvudcelltyper: marginella, mellanliggande och basala celler12 (figur 1).
Marginalceller är förbundna med täta korsningar för att bilda SV: s mest mediala yta. Det apikala membranet vetter mot endolymfen i scala media och bidrar till kaliumjontransport till endolymfen med hjälp av olika kanaler, inklusive KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 och Na + –K + -ATPas (NKA) 5,10,13,14. Intermediära celler är pigmenterade celler som finns mellan marginal- och basalceller och underlättar kaliumtransport genom SV med användning av KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basalceller ligger i närheten av cochleans sidovägg och är nära associerade med fibrocyter i spiralligamentet för att främja kaliumåtervinning från perilymph12. Patologi av SV har varit inblandad i många otologiska störningar17,18. Mutationer i gener uttryckta i de viktigaste SV-celltyperna, såsom Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 och Cldn11, kan orsaka dövhet och SV-dysfunktion, inklusive förlust av EP 19,20,21,22,23. Förutom de tre huvudcelltyperna finns det andra mindre studerade celltyper i SV, såsom spindelceller 22, rotceller12,24, makrofager 25, pericyter 26 och endotelceller 27, som har ofullständigt definierade roller som involverar jonisk homeostas och generering av EP 28.
I jämförelse med bulk-RNA-sekvensering ger enkärnig RNA-sekvensering (sNuc-Seq) information om cellheterogenitet, snarare än ett genomsnitt av mRNA över en grupp celler29, och kan vara särskilt användbar när man studerar den heterogena SV30. Till exempel har sNuc-Seq producerat transkriptionsanalys som tyder på att det kan finnas en roll för spindel och rotceller i EP-generering, hörselnedsättning och Ménières sjukdom18. Ytterligare transkriptionell karakterisering av de olika SV-celltyperna kan ge oss ovärderlig information om patofysiologin bakom olika mekanismer och subtyper av SV-relaterade hörselfluktuationer och hörselnedsättning. Skörden av dessa känsliga inre öronstrukturer är av största vikt för optimal vävnadsanalys.
I denna studie beskrivs mikrodissektionsmetoden för att komma åt och isolera stria vascularis från den vuxna mussnäckan för sNuc-Seq eller immunfärgning. Dissektion av den vuxna musen SV krävs för att förstå olika SV-celltyper och ytterligare karakterisera deras roll i hörseln.
Före tillkomsten av encellssekvensering använde många forskare bulkvävnadsanalys, vilket bara gjorde det möjligt att analysera transkriptom i genomsnitt över celler. I synnerhet gjorde encell och sNuc-Seq det möjligt att isolera transkriptomet av en enda cell respektive enstaka kärna32. I detta fall kan transkriptom med en kärna identifieras för marginal-, mellan- och basalceller samt spindelceller30. Detta möjliggör undersökning av transkriptionell heterogenit…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes delvis av NIH: s intramurala forskningsprogram, NIDCD till MH (DC000088)
10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |