Dissektion av vuxen mus Stria vascularis för sekvensering av en kärna eller immunfärgning

Summary

Den stria vascularis är avgörande för genereringen av endokokleär potential. Här presenterar vi dissektionen av den vuxna musen stria vascularis för sekvensering av en kärna eller immunfärgning.

Abstract

Endokokleär potential, som genereras av stria vascularis, är avgörande för att upprätthålla en miljö som bidrar till lämplig hårcellsmekanotransduktion och slutligen hörsel. Patologier av stria vascularis kan leda till minskad hörsel. Dissektion av den vuxna stria vascularis möjliggör fokuserad enkärnig infångning och efterföljande sekvensering och immunfärgning med en kärna. Dessa tekniker används för att studera stria vascularis patofysiologi på encellsnivå.

Enkärnig sekvensering kan användas vid inställning av transkriptionsanalys av stria vascularis. Samtidigt fortsätter immunfärgning att vara användbar för att identifiera specifika populationer av celler. Båda metoderna kräver korrekt stria vascularis-dissektion som en förutsättning, vilket kan visa sig vara tekniskt utmanande.

Introduction

Cochlean består av tre vätskefyllda kamrar, scala vestibuli, scala media och scala tympani. Scala vestibuli och scala tympani innehåller vardera perilymfa, som har en hög koncentration av natrium (138 mM) och en låg koncentration av kalium (6,8 mM)¹. Scalamediet innehåller endolymf, som har en hög koncentration av kalium (154 mM) och en låg koncentration av natrium (0,91 mM)^1,2,3. Denna skillnad i jonkoncentration kan kallas endokokleär potential (EP), och genereras främst av rörelsen av kaliumjoner genom olika jonkanaler och gapkorsningar i stria vascularis (SV) längs sidoväggen i cochlea 4,5,6,7,8,9,11 . SV är en heterogen, mycket vaskulär vävnad som leder den mediala aspekten av cochleans sidovägg och innehåller tre huvudcelltyper: marginella, mellanliggande och basala celler¹² (figur 1).

Marginalceller är förbundna med täta korsningar för att bilda SV: s mest mediala yta. Det apikala membranet vetter mot endolymfen i scala media och bidrar till kaliumjontransport till endolymfen med hjälp av olika kanaler, inklusive KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 och Na + –K ⁺ -ATPas (NKA) ^5,10,13,14. Intermediära celler är pigmenterade celler som finns mellan marginal- och basalceller och underlättar kaliumtransport genom SV med användning av KCNJ10 (Kir 4.1)^15,16. Basalceller ligger i närheten av cochleans sidovägg och är nära associerade med fibrocyter i spiralligamentet för att främja kaliumåtervinning från perilymph¹². Patologi av SV har varit inblandad i många otologiska störningar^17,18. Mutationer i gener uttryckta i de viktigaste SV-celltyperna, såsom Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 och Cldn11, kan orsaka dövhet och SV-dysfunktion, inklusive förlust av EP 19,20,21,22,23. Förutom de tre huvudcelltyperna finns det andra mindre studerade celltyper i SV, såsom spindelceller 22, rotceller^12,24, makrofager 25, pericyter 26 och endotelceller 27^, som har ofullständigt definierade roller som involverar jonisk homeostas och generering av EP ²⁸.

I jämförelse med bulk-RNA-sekvensering ger enkärnig RNA-sekvensering (sNuc-Seq) information om cellheterogenitet, snarare än ett genomsnitt av mRNA över en grupp celler²⁹, och kan vara särskilt användbar när man studerar den heterogena SV³⁰. Till exempel har sNuc-Seq producerat transkriptionsanalys som tyder på att det kan finnas en roll för spindel och rotceller i EP-generering, hörselnedsättning och Ménières sjukdom¹⁸. Ytterligare transkriptionell karakterisering av de olika SV-celltyperna kan ge oss ovärderlig information om patofysiologin bakom olika mekanismer och subtyper av SV-relaterade hörselfluktuationer och hörselnedsättning. Skörden av dessa känsliga inre öronstrukturer är av största vikt för optimal vävnadsanalys.

I denna studie beskrivs mikrodissektionsmetoden för att komma åt och isolera stria vascularis från den vuxna mussnäckan för sNuc-Seq eller immunfärgning. Dissektion av den vuxna musen SV krävs för att förstå olika SV-celltyper och ytterligare karakterisera deras roll i hörseln.

Protocol

Alla djurförsök och procedurer utfördes enligt protokoll som godkänts av djurvårds- och användningskommittén vid National Institute of Neurological Diseases and Stroke och National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alla experimentella protokoll godkändes av djurvårds- och användningskommittén vid National Institute of Neurological Diseases and Stroke och National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alla me…

Representative Results

Vi presenterar en metod för att isolera SV som ska användas för antingen sNuc-Seq eller immunfärgning. Den relevanta anatomin (figur 1) för cochlean i förhållande till SV kan hjälpa användare att bättre förstå organisationen av SV och stegen i dissektionsprotokollet. Varje steg i denna mikrodissektion av SV från en P30-mus beskrivs i den tillhörande videon, och ögonblicksbilder av de viktigaste stegen i denna dissektion och isolering av SV presenter…

Discussion

Före tillkomsten av encellssekvensering använde många forskare bulkvävnadsanalys, vilket bara gjorde det möjligt att analysera transkriptom i genomsnitt över celler. I synnerhet gjorde encell och sNuc-Seq det möjligt att isolera transkriptomet av en enda cell respektive enstaka kärna³². I detta fall kan transkriptom med en kärna identifieras för marginal-, mellan- och basalceller samt spindelceller³⁰. Detta möjliggör undersökning av transkriptionell heterogenit…

Materials

10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections