Dissectie van volwassen muis Stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining

Summary

De stria vascularis is van vitaal belang voor het genereren van endocochleair potentieel. Hier presenteren we de dissectie van de volwassen muis stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining.

Abstract

Endocochleair potentieel, dat wordt gegenereerd door de stria vascularis, is essentieel om een omgeving te behouden die bevorderlijk is voor geschikte haarcelmechanotransductie en uiteindelijk gehoor. Pathologieën van de stria vascularis kunnen leiden tot een verminderd gehoor. Dissectie van de volwassen stria vascularis maakt gerichte single-nucleus capture en daaropvolgende single-nucleus sequencing en immunostaining mogelijk. Deze technieken worden gebruikt om stria vascularis pathofysiologie op eencellig niveau te bestuderen.

Single-nucleus sequencing kan worden gebruikt in de setting van transcriptionele analyse van de stria vascularis. Ondertussen blijft immunostaining nuttig bij het identificeren van specifieke populaties van cellen. Beide methoden vereisen een goede stria vascularis-dissectie als voorwaarde, wat technisch uitdagend kan blijken te zijn.

Introduction

Het slakkenhuis bestaat uit drie met vloeistof gevulde kamers, de scala vestibuli, scala media en scala tympani. De scala vestibuli en scala tympani bevatten elk perilymfe, dat een hoge concentratie natrium (138 mM) en een lage concentratie kalium (6,8 mM)¹ heeft. Het scala media bevat endolymfe, dat een hoge concentratie kalium (154 mM) en een lage concentratie natrium (0,91 mM)^1,2,3 heeft. Dit verschil in ionenconcentratie kan worden aangeduid als de endocochleaire potentiaal (EP) en wordt voornamelijk gegenereerd door de beweging van kaliumionen door verschillende ionkanalen en gap junctions in de stria vascularis (SV) langs de zijwand van het slakkenhuis 4,5,6,7,8,9,10,11 . De SV is een heterogeen, sterk gevasculariseerd weefsel dat het mediale aspect van de laterale wand van het slakkenhuis bekleedt en drie hoofdceltypen bevat: marginale, intermediaire en basale cellen¹² (figuur 1).

Marginale cellen zijn verbonden door tight junctions om het meest mediale oppervlak van de SV te vormen. Het apicale membraan staat tegenover de endolymfe van de scala-media en draagt bij aan het transport van kaliumionen naar de endolymfe met behulp van verschillende kanalen, waaronder KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 en Na + –K ⁺ -ATPase (NKA) ^5,10,13,14. Tussenliggende cellen zijn gepigmenteerde cellen die zich tussen marginale en basale cellen bevinden en kaliumtransport door de SV vergemakkelijken met behulp van KCNJ10 (Kir 4.1)^15,16. Basale cellen liggen in de nabijheid van de laterale wand van het slakkenhuis en zijn nauw verbonden met fibrocyten van het spiraalligament om kaliumrecycling van de perilymfe¹² te bevorderen. Pathologie van de SV is betrokken bij tal van otologische aandoeningen^17,18. Mutaties in genen die tot expressie komen in de belangrijkste SV-celtypen, zoals Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 en Cldn11, kunnen doofheid en SV-disfunctie veroorzaken, waaronder het verlies van EP 19,20,21,22,23. Naast de drie belangrijkste celtypen zijn er andere minder bestudeerde celtypen in de SV, zoals spindelcellen 22, wortelcellen^12,24, macrofagen 25, pericyten 26 en endotheelcellen 27^, die onvolledig gedefinieerde rollen hebben met ionische homeostase en het genereren van EP ²⁸.

In vergelijking met bulk RNA-sequencing biedt single-nuclei RNA-sequencing (sNuc-Seq) informatie over celheterogeniteit, in plaats van een gemiddelde van mRNA over een groep cellen²⁹, en kan bijzonder nuttig zijn bij het bestuderen van de heterogene SV³⁰. SNuc-Seq heeft bijvoorbeeld transcriptionele analyse geproduceerd die suggereert dat er een rol kan zijn voor spindel- en wortelcellen bij het genereren van EP’s, gehoorverlies en de ziekte van Ménière¹⁸. Verdere transcriptionele karakterisering van de verschillende SV-celtypen kan ons waardevolle informatie verschaffen over de pathofysiologie die ten grondslag ligt aan verschillende mechanismen en subtypen van SV-gerelateerde gehoorfluctuatie en gehoorverlies. De oogst van deze delicate binnenoorstructuren is van het grootste belang voor een optimale weefselanalyse.

In deze studie wordt de microdissectiebenadering beschreven om toegang te krijgen tot en de stria vascularis te isoleren van het volwassen muizenslakkenhuis voor sNuc-Seq of immunostaining. Dissectie van de volwassen muis SV is nodig om verschillende SV-celtypen te begrijpen en hun rol in het gehoor verder te karakteriseren.

Protocol

Alle dierproeven en procedures werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke en het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke en het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, Natio…

Representative Results

We presenteren een methode om de SV te isoleren voor gebruik voor sNuc-Seq of immunostaining. De relevante anatomie (figuur 1) van het slakkenhuis ten opzichte van de SV kan gebruikers helpen de organisatie van de SV en de stappen van het dissectieprotocol beter te begrijpen. Elke stap van deze microdissectie van SV van een P30-muis wordt gedetailleerd beschreven in de bijbehorende video en snapshots van de belangrijkste stappen van deze dissectie en isolatie van …

Discussion

Vóór de komst van single-cell sequencing gebruikten veel onderzoekers bulkweefselanalyse, die het alleen mogelijk maakte om transcriptomen gemiddeld over cellen te analyseren. In het bijzonder maakten single-cell en sNuc-Seq het mogelijk om het transcriptoom van een enkele cel of enkele kern te isoleren, respectievelijk³². In dit geval kunnen transcriptomen met één kern worden geïdentificeerd voor marginale, intermediaire en basale cellen, evenals spindelcellen³⁰. Dit …

Materials

10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections