Denne rapport indeholder protokoller til samling, cellekultur og analyser på μSiM-platformen til konstruktion af blod-hjerne-barrieremodeller.
MicroSiM (μSiM) er en membranbaseret kulturplatform til modellering af blod-hjerne-barrieren (BBB). I modsætning til konventionelle membranbaserede platforme giver μSiM eksperimentalister nye muligheder, herunder levende cellebilleddannelse, uhindret parakrin signalering mellem ‘blod’ og ‘hjerne’ kamre og evnen til direkte at afbilde immunfluorescens uden behov for ekstraktion/genmontering af membraner. Her demonstrerer vi den grundlæggende anvendelse af platformen til at etablere monokultur (endotelceller) og co-kultur (endotelceller og pericytter) modeller af BBB ved hjælp af ultratynde nanoporøse siliciumnitridmembraner. Vi demonstrerer kompatibilitet med både primære cellekulturer og humane inducerede pluripotente stamcellekulturer (hiPSC). Vi leverer metoder til kvalitativ analyse af BBB-modeller via immunofluorescensfarvning og demonstrerer brugen af μSiM til kvantitativ vurdering af barrierefunktion i et lille molekylepermeabilitetsassay. De metoder, der stilles til rådighed, bør gøre det muligt for brugerne at etablere deres barrieremodeller på platformen og fremme anvendelsen af vævschipteknologi til undersøgelse af humant væv.
Levende væv er opdelt af specialiserede celler, der skaber og opretholder barrierer og regulerer, hvilke celler og molekyler der transporteres fra et rum til et andet. Forkert regulering af barrierefunktioner kan være kilden til både akutte sygdomme og kronisk sygdom. Blod-hjerne-barrieren (BBB) er den mest restriktive vævsbarriere i menneskekroppen1. Dysfunktion af BBB ligger til grund for en bred vifte af sygdomme i centralnervesystemet (CNS), herunder Alzheimers sygdom2, Parkinsons sygdom 3,4 og multipel sklerose 5,6. Skader på BBB er også forbundet med langvarig kognitiv svækkelse som følge af akutte lidelser, såsom sepsis7, COVID-198 og postoperativt delirium9. Udviklingen af lægemidler med potentiale til behandling af hjernesygdomme har været frustrerende vanskelig på grund af udfordringen med bevidst at bryde BBB for at levere bioaktive molekyler til mål i hjernen10. Af disse grunde er metoder til undersøgelse af BBB-funktion in vitro af afgørende betydning for forståelsen og behandlingen af sygdomme i CNS.
De grundlæggende metoder til måling af barrierefunktion in vitro involverer etablering af et monolag eller en samkultur på en semipermeabel membran og måling af cellernes modstand mod enten små molekyleriffusion eller små elektriske strømme11,12,13,14. Mens fremkomsten af mikrofysiologiske systemer (MPS) har produceret en overflod af valg til modellering af BBB i 3D15,16, gør mangfoldigheden af systemgeometrier det vanskeligt at sammenligne permeabilitetsmålinger mellem MPS eller med etablerede litteraturværdier. Etableringen af pålidelige baselineværdier er særlig vigtig i BBB-forskning, hvor de vitro-permeabilitetsværdier på grund af den omfattende barriereregulering af hjernevaskulære endotelceller undersøges nøje12,17,18. Af disse grunde vil permeabilitetsmålinger på tværs af monolag etableret på 2D-membraner forblive en hæfteklammer i BBB-undersøgelser i de kommende år. Dette gælder for andre vævsbarrierer, herunder epitelbarrierer, hvor absolutte værdier for baselinepermeabilitet anvendes til at validere og sammenligne in vitro-modeller 19,20,21.
Med det mål at etablere et værdifuldt nyt værktøj til BBB-forskningssamfundet har vi introduceret 22 og avanceret23,24,25,26 mikroenhedenmed en silicon membrane (μSiM) platform til brug i barrierevævsmodellering i løbet af de sidste 5 år. Platformens aktiveringsfunktion er en ultratynd (<100 nm tyk) membran med hundreder af millioner nanoporer 27,28 eller en blanding af nanoporer og mikroporer29. De fritstående membranchips produceres på en 300 μm silicium ‘chip’, der stabiliserer de ultratynde strukturer30 og gør det muligt at håndtere dem med pincet til enhedsmontering. På grund af deres ultratynde natur har membranerne en permeabilitet, der er to størrelsesordener højere end for konventionelle sporætsede membraner, der anvendes i kommercielle membrankulturanordninger31,32. I praksis betyder det, at membranens hindring for diffusion af molekyler, der er mindre end nanoporerne (<60 nm), er ubetydelig33. For cellulære barrierer vil således kun cellerne og matricerne, de deponerer, bestemme hastigheden af små molekyletransporter fra de apikale til basale rum, der adskilles af membranen34. Enhedens design og membranernes ultratynde natur giver også mange fordele ved optisk mikroskopi. Disse omfatter 1) evnen til at følge levende kulturer ved hjælp af fasekontrast eller lysfeltbilleddannelse, 2) evnen til fluorescerende at plette og afbilde in situ uden behov for at ekstrahere og overføre membranen til et dækglas og 3) det faktum, at membranerne er tyndere end konfokale ‘skiver’, så direkte co-kulturer har en mere naturlig afstand mellem celletyper, end det kan opnås med 6-10 μm tykke sporætsede membraner.
Senest avancerede vi platformen til et modulært format for at lette hurtig montering34 og tilpasning35,36. Vi udnyttede det modulære format til at distribuere enhedskomponenter mellem vores bioengineering og samarbejdende hjernebarrierelaboratorier. Derefter udviklede vi i fællesskab protokoller til enhedssamling, monokultur og cokultur, immunofluorescerende farvning og små molekylepermeabiliteter og viste, at disse metoder var reproducerbare mellem laboratorier. Ved hjælp af disse protokoller viste vi også, at den modulære platform understøtter en valideret BBB udviklet ved hjælp af den udvidede endotelkulturmetode (EECM) til at skabe hjernemikrovaskulære endotellignende endotelceller (BMEC) fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er)37. Formålet med den aktuelle rapport er at gennemgå disse metoder mere detaljeret og ved hjælp af den ledsagende video lette en bredere vedtagelse af platformen i BBB-samfundet.
Mens membranchips er designet til stabilitet, kan de revne eller gå i stykker, hvis de håndteres forkert under samlingen. Det er således vigtigt at gribe chippen i chippincethakene og forsigtigt placere den i armaturet. Ved håndtering af enhederne generelt skal der tages ekstra forholdsregler for ikke at støde eller tabe enhederne. Under limningen af membranchippen til armatur A1 skal chippen lægges fladt og centreret på søjlen i armatur A1 for at undgå membranrevner under limningen til komponent 1. Endvidere skal enhver kontakt med de udsatte PSA-lag undgås efter fjernelse af beskyttelsesmasker. Når du håndterer komponent 2 efter fjernelse af beskyttelsesmaskerne, anbefales det at holde den langs komponentens kant og bruge pincet til at få fat i trekanthjørnet, der er PSA-frit.
Mens cellekulturprotokoller blev beskrevet for mulige BBB-modeller, kan BMEC / pericyt-cokulturmodellen for BBB beskrevet her være tilstrækkelig eller utilstrækkelig afhængigt af den fysiologiske kontekst og spørgsmål af interesse. For eksempel forekommer immuncellehandel stort set i hjernens postkapillære venuler41,42. I disse regioner adskiller et perivaskulært rum BMEC / pericytbarrieren fra gliagrænserne etableret af astrocytter. I postkapillære venuler består den neurovaskulære enhed (NVU) således af to fysisk adskilte barrierer i serie, og astrocytiske endefødder kommer ikke direkte i kontakt med BMEC / pericytblodbarrieren, som er godt repræsenteret af den nuværende model. Hvis målet er en NVU-model, der tegner sig for virkningen af astrocytudskillede faktorer på blodbarrieren, kan der tilføjes et astrocytrum til enheden, der tillader opløselig faktorudveksling gennem det perivaskulære rum. Dette eksempel blev illustreret tidligere34 og kunne udvides til at omfatte andre celler såsom mikroglia og neuroner i et 3D ‘hjerne’ rum. Platformens modulære arkitektur gør det muligt at bruge enkle monteringsstrategier til at opnå disse omkonfigurationer, så platformen er så enkel eller kompleks som nødvendigt for at løse de foreliggende hypoteser. Hver cellekultur opsætning; skal dog optimeres til nye cellelinjer og multikulturer. På grund af siliciumnitridmembranernes egenskaber kan det f.eks. være nødvendigt at justere belægningsopløsningerne sammenlignet med vævskulturplader. Inkluderingen af fibronectin hjælper typisk med cellevedhæftning og overlevelse. Desuden kunne brugerne dyrke endotelceller og pericytter i modsatte retninger. I dette tilfælde kan det være nødvendigt at ændre for eksempel den måde, permeabilitetsmålingerne foretages og fortolkes på. At give skridt til denne type kultur ligger imidlertid uden for rammerne af dette papir.
En anden udfordring, man kan støde på under cellekultur, er den hurtige fordampning af medier, da enhederne kan være mere følsomme over for ændringer i miljøet sammenlignet med standard vævskulturplader og kolber. Hvis der ses overskydende fordampning, eller cellevæksten bremses, skal alle kritiske inkubatorparametre måles for at sikre nøjagtige indstillinger. Mere vand kan tilsættes til vævshætten eller lille petriskål, der er placeret inde i cellekulturkammeret, eller medier skal udskiftes oftere. Yderligere kan bobler komme ind i bundkanalen og sidde fast i grøften til grøft-down enheder. Mens de kan fjernes, er det nemmest at undgå at tilføje bobler i første omgang. For at gøre dette er det vigtigt at kontrollere, at der ikke er bobler i pipettespidsen eller luft i enden af pipettespidsen, før mediet pipetteres ind i det nederste kammer. Endvidere kan mediefordampning i kanalen føre til et mellemrum mellem medieoverfladen og porttoppen. En lille mængde medier kan pipetteres ind i en port, indtil mediet når overfladen af den modsatte port, hvorefter mediet kan udskiftes i den modsatte port. Mens hECSR og E6 + 10% FBS-medier ikke bør opvarmes i vandbadet, kan andre medier forvarmes for at reducere bobledannelse. Hvis en boble kommer ind i bundkammeret, kan den fjernes ved hurtigt at pipettere 100 μL gennem kanalen. Denne metode kan dog føre til forurening mellem kamre eller medier, der spildes over enhedens overflade. Det kan også forstyrre cellelag. Alternativt kan mediet først fjernes fra kanalen og derefter genindføres med et volumen på 50 μL. Fjernelse af mediet først kan dog resultere i mere bobledannelse i kanalen. Hvis en boble ikke er direkte under membranområdet, kan den efterlades i kanalen uden virkninger på cellekulturen.
Pericyttilknytning og vækst, som vist i figur 2, kan være udfordrende. Brug af en optimeret såtæthed er afgørende for dannelsen af et lag med et fysiologisk relevant pericyt-til-endotelcelleforhold. Da pericytterne er følsomme over for forskydning, skal alle medieudvekslinger i kanalen udføres meget langsomt for at beskytte cellerne. Til BPLC-kultur kan forbedret vedhæftning opnås ved at belægge bundkammeret med 800 μg / ml kollagen type IV eller 100 μg / ml fibronectin.
Immuncytokemi i udstyr beskrevet her muliggør kvalitativ analyse af cellesundhed og funktion. Metoder til farvning i vævskulturplader eller andre platforme skal kunne oversættes direkte til platformen. For cellekultur i kun det øverste kammer, efter fiksering, kan PBS tilsættes i det nederste kammer og efterlades i de resterende trin, med blokering og farvning kun udført i det øverste kammer. Dette minimerer risikoen for at bryde membranerne eller få bobler ind i bundkammeret. Til co-kulturfarvning anbefaler vi at bruge begge kamre i alle trin. Det er vigtigt at bemærke, at viskositeten af fikseringsmidlet og PBS er forskellig fra mediets. Det kan således være lettere at tilføje bobler i det nederste kammer, og man bør være ekstra omhyggelig med at kontrollere pipettespidserne for luft for enden af spidsen, inden pipetten pipetteres ind i bundkammeret.
Den beskrevne protokol for analysen af små molekylers permeabilitet muliggør funktionel og kvantitativ vurdering af barrierefunktionen af endotelcellerne dyrket i μSiM-indretningen. Et problem, der kan opstå under denne analyse, er at trække luftbobler ind i pipetten under prøveopsamling fra den nederste kanal ved protokoltrin 4.1.7.4. For at undgå dette problem er det vigtigt at sørge for, at spidsen er forseglet i porten, før prøveindsamlingen påbegyndes, og prøven bør ikke trækkes for hurtigt. Hvis det ikke løser problemet, kan størrelsen på de anvendte spidser være for lille eller for stor til at passe ind i portene; Brug de tips, der er anført i materialetabellen. Hvis der måles uventet høje permeabilitetsværdier på trods af et sundt udseende sammenflydende monolag, skal monolagets integritet kontrolleres for forstyrrelser under prøveindsamlingen. Vi anbefaler altid at kontrollere monolaget under mikroskopet umiddelbart efter prøveindsamling. Hvis monolaget stadig virker intakt og sundt, kan prøven fikseres, og biologiske markører for barrierefunktion kan vurderes, f.eks. via immunfarvning af forbindelsesproteinerne. Omvendt, hvis uventet lave permeabilitetsværdier måles, er det vigtigt at sikre, at 50 μL medier samples fra den nederste kanal uden luftbobler. Hvis substratet kommer ud fra prøveudtagningsporten, så snart reservoirspidsen er anbragt, skal dette medie opsamles, inden pipetten anbringes i prøveudtagningsporten, da det meste af det lille fluorescerende molekyle vil være til stede i det indledende volumen på 10 μL, der udtages prøver fra den nederste kanal. Tegning af cirkler rundt om portene ved hjælp af en hydrofob pen eller placering af et hydrofob bånd med et hul omkring porten forhindrer passivt pumpede medier i at sprede sig. Hvis boblerne trækkes ud under prøveudtagningen, eller den fulde prøve på 50 μL ikke fjernes, må prøven ikke anvendes. Alternativt kan det nøjagtige volumen bestemmes og anvendes i permeabilitetsberegningen; Dette bør dog kun gøres, hvis det fjernede volumen er ≥40 μL, hvilket svarer til ~98-99% farvestofgenvinding34.
The authors have nothing to disclose.
J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. og L.W. blev finansieret af NIH-tilskud R33 HL154249. J.L.M. blev finansieret af R44 GM137651. M.M. blev finansieret af Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester. M.T. blev finansieret af RF1 AG079138. K.C. blev finansieret af International Foundation for Ethical Research.
Antibodies | |||
CD31 Polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-32321 | |
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 | Millipore | MAB2029 | |
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 | Cell Signaling Technology | 3169 | |
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 | R&D Systems | MAB9381 | |
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
100% Methanol | VWR | 101443-718 | Can be substituted with similar products |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Can be substituted with similar products |
Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
B27 supplement | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Can be substituted with similar products |
DMEM/Ham’s F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Essential 6 medium | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Peak Serum | PS-FB1 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fibronectin human protein, plasma | ThermoFisher Scientific | 33016015 | Can be substituted with similar products |
hESFM | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | 861502 | |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 500627 | Can be substituted with similar products |
PBS without calcium, magnesium | Cytiva | SH30256.01 | Can be substituted with similar products |
Pericyte Medium | ScienCell | 1201 | Use complete kit (includes supplements) |
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL | ScienCell | 0413 | |
Triton X-100 | JT Baker | X198-05 | Can be substituted with similar products |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen™ | 10977015 | Can be substituted with similar products |
Experimental models: Cell lines | |||
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line | Sigma-Aldrich | SCC066 | |
Human brain vascular pericytes | ScienCell | 1200 | |
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells | WiCell | RRID:CVCL_C437 | |
Glassware and Plasticware | |||
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid | Falcon | 353025 | |
Clamps | VWR | MFLX06832-10 | |
Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
Flat 96-well non-binding microplates | Greiner Bio-One | 655900 | |
Microscope Slide Device Holder | SiMPore | USIM-SB | Dimensions compatible with micropscope slide holders |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339653 | Tube caps can be filled with water for cell culture |
P20-200 pipette tips | VWR | 76322-516 | Alternate brands may not seal as effectively into ports |
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) | CoStar | 3401 | |
Instruments | |||
10X Objective (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD00105 | Air; WD: 4 mm; NA 0.45 |
10X Objective (For Nikon) | Nikon Instruments Inc. | MRP40102 | Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25 |
40X Objective (LWD) (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD77410 | Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15 |
Andor Spinning Disc Confocal microscope | Oxford Instruments, Andor | ||
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope | Nikon Instruments Inc. | Can be substituted with similar products | |
TECAN Infinite M200 | TECAN | Can be substituted with similar products | |
Other | |||
Advanced PAP Pen | Millipore Sigma | Z672548 | 2 mm tip is recommended |
Assembly kit with fixtures | SiMPore | USIM-JIGSET | Including fixure A1, A2, B1, and B2 |
Camera Adapter for Microscopes | AmScope | CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR | Φ23.2 – Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2 |
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera | Canon | EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 | Can be substituted with similar products |
Cell strainer, 40 µm | Millipore Sigma (Corning) | CLS431750 | |
Component 1 | SiMPore | USIM-C1 | |
Component 2 | SiMPore | USIM-C2 | |
Membrane chips | SiMPore | NPSN100-1L | Other chips formats are available |
SMD handling tweezer double angle | Techni-Tool | 758TW003 | "Chip Tweezers" |
Stainless steel precision type GG tweezer | Techni-Tool | 758TW534 | "Straight Tweezers" |
Software | |||
Fiji | ImageJ | For image processing | |
Fusion | Oxford Instruments, Andor | Instructions for version 2.3.0.44 | |
i-control | TECAN | Instructions for version 2.0 | |
Imaris | Oxford Instruments | For image processing. Instructions for version 9.9.0 |