Denna metod eliminerar alla större invasioner under cellinjektioner orsakade av cellsuspensionslösningen.
Att injicera celler direkt i vävnader är en nödvändig process vid celladministrering och/eller substitutionsterapi. Cellinjektionen kräver en tillräcklig mängd suspensionslösning för att cellerna ska kunna tränga in i vävnaden. Suspensionslösningens volym påverkar vävnaden, och detta kan orsaka stor invasiv skada till följd av cellinjektionen. Denna artikel rapporterar om en ny cellinjektionsmetod, kallad långsam injektion, som syftar till att undvika denna skada. Att trycka ut cellerna från nålspetsen kräver dock en tillräckligt hög injektionshastighet enligt Newtons lag om skjuvkraft. För att lösa ovanstående motsägelse användes en icke-newtonsk vätska, såsom gelatinlösning, som cellsuspensionslösning i detta arbete. Gelatinlösning har temperaturkänslighet, eftersom deras form ändras från gel till sol vid cirka 20 °C. För att hålla cellsuspensionslösningen i gelform hölls sprutan därför kyld i detta protokoll. Men när lösningen injicerades i kroppen omvandlade kroppstemperaturen den till en sol. Det interstitiella vävnadsvätskeflödet kan absorbera överflödig lösning. I detta arbete tillät den långsamma injektionstekniken kardiomyocytbollar att komma in i värdens myokardium och transplantera utan omgivande fibros. I denna studie användes en långsam injektionsmetod för att injicera renade och bollformade kardiomyocyter från nyfödda råttor i ett avlägset område med hjärtinfarkt i det vuxna råtthjärtat. 2 månader efter injektionen uppvisade hjärtan hos de transplanterade grupperna signifikant förbättrad kontraktil funktion. Dessutom avslöjade histologiska analyser av de långsamt injicerade hjärtana sömlösa kopplingar mellan värden och transplantatkardiomyocyterna via interkalerade skivor som innehöll gap junction-anslutningar. Denna metod kan bidra till nästa generations cellterapier, särskilt inom hjärtregenerativ medicin.
Administrering och ersättning av celler är lovande nya terapeutiska strategier för kraftigt skadade organ. Bland dessa nya terapeutiska strategier har hjärtregenerativ medicin väckt stor uppmärksamhet. Inflammationen som orsakas av skador förmedlar dock ärrbildning i flera organ 1,2,3,4. Det mänskliga hjärtat består av cirka 1010 kardiomyocyter; Därför, teoretiskt5,6, måste den behandlas med mer än 109 kardiomyocyter. Administrering av ett stort antal kardiomyocyter via traditionella injektionsmetoder kan leda till betydande vävnadsskador7. Denna metod ger en ny cellinjektionsmetod med minimal vävnadsinvasion.
Celladministrering i organparenkymet kräver injektion(er). Det finns dock en diskrepans i och med att injektionen i sig kan leda till vävnadsskada. Vävnadsskada orsakar lokal inflammation och obotlig ärrbildning i organ och vävnader, samt nedsatt regenerativ förmåga 8,9,10. Däggdjurshjärtat har en extremt hög benägenhet att utveckla ärr istället för att regenerera eftersom det kräver omedelbar skadereparation för att uthärda det höga blodtrycket som orsakas av dess kontinuerligapumpfunktion. Ablationsterapi utnyttjar denna höga benägenhet för ärrbildning och blockerar kretsen som sannolikt kommer att genomgå ärrbildning med hjälp av arytmi12. I en tidigare studie observerades att ärrvävnaden isolerade de injicerade kardiomyocyterna i värdens hjärtmuskel. Således representerar detta nästa målfråga som måste övervinnas för att uppnå förbättrad terapeutisk effekt inom hjärtregenerativ medicin.
Interstitiellt vätskeflöde i vävnad spelar en viktig roll för att transportera syre och näringsämnen till cellerna och ta bort det utsöndrade avfallet från cellerna. Den fysiologiska hastigheten för interstitiellt vätskeflöde i varje vävnad/organ är olika (intervallet är 0,01-10 μm/s)13. Så vitt författaren vet finns det inga data om enskilda vävnaders/organs förmåga att stödja extra mängder vätska utan patologiskt ödem; Detta experiment försöker dock använda en långsam injektionshastighet för att eventuellt minska vävnadsskadan, och resultaten kan användas för att bestämma det praktiska i detta koncept.
En av de kritiska punkterna för att den långsamma injektionsmetoden ska fungera framgångsrikt är att förbereda ett effektivt injektionssystem med hjälp av en kraftfull sprutpump och ett starkt trycköverföringsrör. Ett högtryckssystem krävs för att trycka ut gelén från spetsen av en fin nål. Den andra kritiska punkten är stabiliseringen av hjärtat. Hjärtats slag mot en injektionsnål som förs in i hjärtmuskeln kan skada vävnaden. I denna studie genomfördes en ekostyrd injektion för att undvika att djuren genomgick en andra öppen bröstskada och för att administrera cellinjektionen i ett stabiliserat hjärta med uppblåsta lungor. I vissa tillämpningar för större djur eller människor bör dessutom vissa injektionsanordningar som fästs på hjärtat övervägas som en del av den strategiska utformningen av tillämpningen. För injektioner med öppen bröstkorg i hjärtat på små djur rekommenderas användning av en lång, flexibel nål med tanke på deras högre hjärtfrekvens.
I detta arbete ökade den långsamma injektionsmetoden signifikant den överlevande kardiomyocytvolymen jämfört med den normala injektionsmetoden. Den normala injektionen orsakar cellskador via skjuvspänning15. Däremot orsakar den långsamma injektionsmetoden inte sådan stress teoretiskt eftersom den använder en icke-newtonsk lösning utöver den långsamma injektionen.
När det gäller lokal fibros uppvisade det interstitiella utrymmet runt de normalt injicerade överlevande kardiomyocyterna en stark och utbredd kollagenavlagring av typ I. Däremot var kollagensignalerna av typ I runt de transplanterade kardiomyocyterna som transplanterades med den långsamma injektionsmetoden mycket svagare och mer begränsade. Detta tyder på att den långsamma injektionsmetoden orsakade betydligt mindre skada. Den långsamma injektionen av neonatala kardiomyocyter i hjärtmuskeln hos vuxna förbättrade signifikant det infarktdrabbade hjärtats kontraktila funktion. De histologiska analyserna tydde på att ympning av kardiomyocyterna med hjälp av den långsamma injektionsmetoden resulterade i direkta förbindelser och funktionell koppling till värdkardiomyocyterna. Detta fenomen förklarar mekanismen för den funktionella återhämtningen av värdmyokardiet. Så vitt vi vet är detta den första rapporten om transplanterade neonatala kardiomyocyter med storskaliga sömlösa kopplingar till de vuxna kardiomyocyterna. De funktionella kopplingarna till värdmyokardium via elektrisk och mekanisk koppling kan få de transplanterade kardiomyocyterna att mogna och göra det möjligt för dem att fungera som funktionella myocyter som bidrar till värdens hjärtfunktion. Långsiktiga fysiska kraftinteraktioner mellan värden och transplantatets kardiomyocyter är avgörande för full mognad. Därför kan det behövas 2 månader efter injektionen för funktionell återhämtning av det infarktdrabbade hjärtat. Den tidsberoende återhämtningen av patientens hjärtfunktion kan vara ett förväntat fenomen i terapeutiska tillämpningar, och detta kan vara ett kännetecken för den framgångsrika etableringen av de novo-funktionell koppling och integration mellan värden och transplanterade kardiomyocyter.
Den långsamma injektionsmetoden kan utföras under öppen bröstkirurgi. Dessutom kan denna metod tillämpas på möss. För framtida tillämpningar inom humanterapi behöver vi fortfarande lösa flera problem. Injektionshastigheten bör optimeras genom att hänsyn tas till buffertkapaciteten hos det interstitiella vätskeflödet i varje humant målorgan. Xenofria material, t.ex. humangelatin eller biologiskt nedbrytbara syntetiska material, bör användas. Klinisk GMP-klassad apparat för långsam injektion, t.ex. kompakta organspecifika engångsverktyg eller en återanvändbar apparat som kan användas med breda organ, bör utvecklas.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av ett anslag från JSPS KAKENHI (anslag nr 23390072 och 19K07335) och AMED (anslag nr A-149).
18-gauge needle & tuberculin, 1 mL | Terumo | NN1838R, SS-01T | |
29-gauge 50 mm-long needle | Ito Corporation, Tokyo, Japan | 14903 Type-A | |
A copper tube | General Suppliers | outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm | |
Ads Buffer | Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35 | |
alpha-MEM | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 051-07615 | |
Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) | Proteintech | 14695-1-AP | using dilution 1:100 |
Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) | Sigma Aldrich | C6219 | using dilution 1:100 |
Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | using dilution 1:300 |
blocking solution (Blocking One) | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 03953-95 | |
collagenase | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 034-22363 | |
confocal laser microscope | Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany | LSM510 META | |
DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
FACS Aria III | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | ||
fetal bovine serum | BioWest, FL, USA | S1820-500 | |
fine movement device (Micromanipulator) | Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan | M-44 | |
fluorescence microscope | Nikon Instruments, Tokyo, Japan | Eclipse Ti2 | |
gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9382 | dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it |
Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats | Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan | 0–2 d after birth | |
non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) | Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan | MS-0096S | |
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA | Tissue-Tek OCT compound | |
peristaltic pump (for cooling system) | As One Co., Osaka, Japan | SMP-23AS | |
PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 | Chemglass life sciences LLC, NJ, USA | CG-2003-120 | |
syringe | Ito Corporation, Tokyo, Japan | MS-N25 | |
syringe pump with remote controller | As One Co., Osaka, Japan | MR-1, CT-10 | |
tetramethylrhodamine methyl ester | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | T668 | |
trypsin | DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 215240 | |
Tween-20 | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 167-11515 | |
veterinarian ointment | Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. | Hibikusu ointment #WAK-95832 | |
Vevo 2100 Imaging System | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
Weakly curved needle with ophthalmic thread | Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan | C7-70 |